薛立芝，張思泉

（杭州市西溪醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310023）

乙型肝炎病毒感染在世界范圍內(nèi)流行，慢性乙型肝炎患者中有約1/3 患者最終會(huì)發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重并發(fā)癥。我國(guó)是乙型肝炎病毒感染率比較高的國(guó)家之一，我國(guó)≥50%肝癌是由長(zhǎng)期慢性乙型肝炎病毒感染所致。慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，表觀遺傳學(xué)在慢性乙型肝炎的發(fā)病中具有重要作用，DNA甲基化為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，為基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控方式之一；在慢性乙型肝炎發(fā)病中存在DNA 異常甲基化[1]。DNMT1為體細(xì)胞內(nèi)最豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶之一，其具有維持DNA甲基化的作用；DNMT1 異?？蓪?dǎo)致基因組穩(wěn)定性下降、原癌基因活性增高、抑癌基因功能喪失，從而在多種疾病及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者肝組織中DNMT1表達(dá)升高，肝組織中DNMT1表達(dá)與患者乙型肝炎、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征關(guān)系密切[3]。介于乙型肝炎為肝癌發(fā)病的主要原因，DNMT1 在乙型肝炎中的表達(dá)及意義值得探討。本文對(duì)慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平及其臨床意義進(jìn)行研究，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2019年12月在杭州市西溪醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者120例作為乙型肝炎組，同期120例健康體檢者作為對(duì)照組。乙型肝炎組男性71例，女性49例；年齡（46.37±9.61）歲。對(duì)照組男性68例，女性52例；年齡（45.93±10.52）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①乙型肝炎組患者有乙型肝炎病史；②＞6個(gè)月乙肝表面抗原陽性史；③對(duì)照組肝功能、乙肝兩對(duì)半及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA 均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等其他肝?。虎诒透窝?、丁型肝炎及戊型肝炎等其他類型肝炎；③并發(fā)肝癌，嚴(yán)重心、肺、腎等臟器疾?。虎軔盒阅[瘤。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)所有患者知情同意參與研究。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 肝臟活檢對(duì)慢性乙型肝炎患者進(jìn)行常規(guī)肝臟活檢，參照Metavir評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行肝炎癥程度和肝纖維化程度評(píng)估：肝炎活動(dòng)度為≤G2為輕度炎癥活動(dòng)，G3及G4為重度炎癥；肝纖維化分期為≤S2 期為輕度肝纖維化，S3 期和S4 期為重度肝纖維化。根據(jù)上述評(píng)估將慢性乙型肝炎患者分為輕度炎癥組52例和重度炎癥組68例；輕度纖維化組56例和重度纖維化組64例。

1.2.2 各指標(biāo)測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、總膽紅素（total bilirubin,TBIL）、對(duì)數(shù)乙肝病毒（log hepatitis B virus,Log HBV）由杭州市西溪醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)；血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、DNMT1水平采用ELISA法測(cè)定（試劑盒購自美國(guó)Sigma公司），具體方法：用純化人TNF-α、DNMT1 抗體包被微孔板，往包被微孔中加入TNF-α、DNMT1，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的TNF-α、DNMT1 抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)為藍(lán)色；在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色，顏色深淺與TNF-α、DNMT1含量呈正相關(guān)。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、DNMT1水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較

兩組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α和DNMT1水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙型肝炎組高于對(duì)照組。見表1。

2.2 乙型肝炎患者血清DNMT1與AST、ALT、TBIL及TNF-α的相關(guān)性分析

乙型肝炎患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL及TNF-α 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較 （n=120，±s）

表1 兩組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較 （n=120，±s）

組別 AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）DNMT1/（μg/L）對(duì)照組 15.12±2.26 16.34±2.64 8.42±1.05 1.12±0.24 24.46±5.74乙型肝炎組 52.61±2.86 85.31±3.02 20.53±1.22 3.14±0.33 35.71±6.02 t值 112.665 188.353 82.416 54.229 14.816 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 乙型肝炎E抗原陽性組與陰性組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較

乙型肝炎E抗原（HBeAg）陽性組與HBeAg陰性組AST、ALT、TBIL、TNF-α、Log HBV和DNMT1比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HBeAg陽性組高于HBeAg陰性組。見表3。

表3 HBeAg陽性組與陰性組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較 （±s）

表3 HBeAg陽性組與陰性組生物化學(xué)指標(biāo)和血清DNMT1水平比較 （±s）

組別 n AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）Log HBV DNMT1/（μg/L）HBeAg陰性組 71 36.57±2.65 44.12±3.24 19.65±3.71 2.49±0.41 2.77±0.32 31.51±4.32 HBeAg陽性組 49 65.64±3.07 122.61±3.78 21.03±3.87 3.82±0.47 5.64±0.38 44.19±4.18 t值 55.341 121.799 2.110 16.447 44.706 16.023 P值 0.000 0.000 0.037 0.000 0.000 0.000

2.4 HBeAg陽性患者血清DNMT1與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV的相關(guān)性分析

HBeAg陽性患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 HBeAg陽性患者血清AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV與DNMT1的相關(guān)性

2.5 不同肝組織炎癥程度患者血清DNMT1水平比較

輕度炎癥組與重度炎癥組患者血清DNMT1水平分別為（29.16±3.13）、（40.36±3.21）μg/L，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.145，P=0.000），重度炎癥組高于輕度炎癥組。

2.6 不同肝纖維化程度患者血清DNMT1水平比較

輕度纖維化組與重度纖維化組患者血清DNMT1水平分別為（31.62±3.27）和（39.17±3.38）μg/L，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.394，P=0.000），重度纖維化組高于輕度纖維化組。

3 討論

表觀遺傳指在未改變基因序列的情況下基因表達(dá)發(fā)生改變，即細(xì)胞內(nèi)遺傳信息外的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，更重要的是這種遺傳物質(zhì)的改變?cè)诩?xì)胞的增殖、生長(zhǎng)中可以穩(wěn)定傳遞給子代[4]。目前發(fā)現(xiàn)的非基因序列變化的表觀遺傳分子機(jī)制有DNA甲基化、組蛋白質(zhì)修飾、RNA 干擾及組蛋白乙?；萚5]。DNA甲基化為表觀遺傳學(xué)研究最多的機(jī)制之一，在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要通過DNMT1、DNMT3 等進(jìn)行調(diào)節(jié)[6]。

DNA甲基化為重要的表觀遺傳學(xué)修飾形式之一，其中DNMT為催化DNA甲基化的重要調(diào)控分子[7]。DNMT 催化DNA甲基化可沉默抑癌基因，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，DNMT1為DNMT的一種類型，在多種惡性腫瘤中過表達(dá)[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1 在肝癌中也存在過表達(dá)[11]。乙型肝炎病毒感染為肝癌發(fā)病的主要原因，DNMT 在乙型肝炎中的作用也受到關(guān)注，如LI 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌中乙型肝炎病毒感染與DNMT表達(dá)關(guān)系密切，肝細(xì)胞癌組織中乙型肝炎病毒感染可上調(diào)DNMT表達(dá)[12]?？灯G紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X 蛋白轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞DNMT 啟動(dòng)子，進(jìn)而上調(diào)DNMT表達(dá)。KOSTYUSHEV 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者DNMT 過表達(dá)。MADEDDU 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者DNMT1 對(duì)線粒體DNA甲基化狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用。上述研究均表明DNMT 參與乙型肝炎的發(fā)病過程。

本研究對(duì)慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乙型肝炎組血清DNMT1水平高于對(duì)照組；HBeAg陽性組DNMT1水平高于HBeAg陰性組；慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相關(guān)，與肝組織炎癥活動(dòng)程度和肝纖維化程度關(guān)系密切。慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)化（即由陽性轉(zhuǎn)化為陰性）為血清學(xué)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，其轉(zhuǎn)化提示患者慢性乙型肝炎病程發(fā)展緩慢、遠(yuǎn)期預(yù)后良好及肝硬化發(fā)病率降低，患者經(jīng)過治療后HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)化表示抗病毒治療效果良好。AST、ALT、TBIL為肝功能的常用指標(biāo)，其水平升高表明患者肝功能異常。TNF-α為常用的炎癥指標(biāo)，其水平升高表明機(jī)體炎癥反應(yīng)程度升高。由此可見，DNMT1 可能參與慢性乙型肝炎的發(fā)病過程，血清DNMT1水平在一定程度上可反映患者的肝功能損傷程度、炎癥活動(dòng)程度和纖維化程度、預(yù)后及療效。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平升高，檢測(cè)血清DNMT1水平在患者肝功能損傷、炎癥程度、纖維化程度和預(yù)后評(píng)估中具有一定參考價(jià)值。