吳捍衛(wèi)，王展，呂美艷，王一

（1.永康市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 永康 321300；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院泌尿外科，浙江 杭州 310052）

感染性肺炎是兒科常見疾病，＞50%患兒直接感染病毒或繼發(fā)于支原體、細(xì)菌感染引起的病毒[1]。鑒于病毒性肺炎具有季節(jié)性的特點(diǎn)，例如流感病毒、新型冠狀病毒、呼吸道合胞病毒等都可能引發(fā)大范圍爆發(fā)和流行，嚴(yán)重危及兒童的生命健康。因此在治療過程中，尋找有效的生物標(biāo)志物用于評(píng)估病情進(jìn)展、臨床療效和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。YKL-40 屬于一類典型的分泌型糖蛋白，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而且在肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用[2]。李智瓊等學(xué)者[3]證實(shí)，YKL-40 在支原體肺炎患兒血清中含量升高，并且可用于輔助診斷和評(píng)價(jià)病情嚴(yán)重程度及預(yù)后。KORTHAGEN 等[4]也發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中YKL-40含量與肺纖維化患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。但是其在病毒性肺炎患兒血清中的含量及臨床意義未見學(xué)者關(guān)注。另外考慮到血清中很多蛋白分子的表達(dá)具有不穩(wěn)定性，易被蛋白酶所降解，因此從上游水平尋找相關(guān)的microRNA（miRNA）作為檢測(cè)指標(biāo)。筆者通過在線生物學(xué)軟件篩查發(fā)現(xiàn)，YKL-40 編碼基因CHI3L1是miR-24的下游靶基因[5]，而且眾多研究也證實(shí)，miR-24在炎癥疾病中也屬于功能性基因[6]。因此本實(shí)驗(yàn)擬研究浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院病毒性肺炎患兒血清miR-24、YKL-40與疾病嚴(yán)重程度、肺功能及預(yù)后的相關(guān)性，以期為指導(dǎo)臨床診斷和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2019年4月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院住院的117例病毒性肺炎患兒作為實(shí)驗(yàn)組。其中，男性74例，女性43例；年齡2～11歲，平均（5.34±2.45）歲；流感病毒37例，呼吸道合胞病毒31例，副流感病毒19例，腺病毒12例，巨細(xì)胞病毒11例，EB病毒7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參考《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南（2013 修訂）》[7]關(guān)于病毒性肺炎和重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)血清分子生物學(xué)及直接免疫熒光法檢測(cè)病毒特異性中和抗體；③所有重癥肺炎患兒需經(jīng)2位兒內(nèi)科副主任及以上醫(yī)師確診；④由患兒法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞；②急慢性炎癥反應(yīng)；③嚴(yán)重肝腎功能障礙；④免疫系統(tǒng)疾??；⑤先天性疾??；⑥反復(fù)呼吸道感染。根據(jù)不同預(yù)后分為痊愈組、好轉(zhuǎn)租及遷延難愈組。另外選取同期本院健康體檢兒童30例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡與納入的病毒性肺炎患兒相匹配；②無基礎(chǔ)性疾病；③近3個(gè)月內(nèi)無呼吸道感染病史；④各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)和血生物化學(xué)指標(biāo)均正常。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑

MasterScreen Paed型肺功能儀（德國耶格公司），One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司），YKL-40 ELISA試劑盒（美國R&D公司），利巴韋林注射液（馬鞍山豐原制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20150114），阿奇霉素注射液（蘇州長(zhǎng)征-欣凱制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20150103）。

1.3 治療方法

所有患兒臨床會(huì)診后靜脈滴注利巴韋林注射液10 mg/kg，1次/d；合并細(xì)菌感染者靜脈滴注阿奇霉素注射液（0.125 g 溶于250 ml 生理鹽水）10 mg/kg，1次/d，7 d為1個(gè)療程。另外給予退熱、鎮(zhèn)咳、祛痰等對(duì)癥治療，1～2個(gè)療程后，采集晨起空腹血液標(biāo)本。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 血清YKL-40所有患兒入院就診時(shí)第一時(shí)間采集肘靜脈血6 ml，靜置20 min，3 000 r/min 離心20 min，離心半徑10 cm，取上清，采用YKL-40 ELISA試劑盒檢測(cè)血清YKL-40含量。

1.4.2 血清miR-24 mRNA采血方法同1.4.1，留取部分血清標(biāo)本，加入Trizol 試劑，提取血清總RNA，采用Thermo Fisher miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。采用SYBR Green 法行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR），冰浴中配制10μl PCR 反應(yīng)體系：正反向引物各0.2μl、2×SYBR Green I Msater 5μl、cDNA 模 板1μl、適量去離子水。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)36個(gè)循環(huán)，從60℃緩慢升至97℃繼續(xù)延伸并收集熒光信號(hào)，繪制熔解曲線。以小分子U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.4.3 潮氣呼吸肺功能采血當(dāng)日患兒口服5%水合氯醛或自然睡眠狀態(tài)下，戴上合適面罩，采用MasterScreen Paed型肺功能儀檢測(cè)患兒潮氣呼吸肺功能，計(jì)算達(dá)峰時(shí)間比（tPTEF/tE），即到達(dá)呼氣峰流速的時(shí)間與呼氣時(shí)間之比。

1.5 臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

治愈：患兒臨床癥狀消失，體溫恢復(fù)正常，且胸部X射線檢查顯示肺部病灶完全消失；好轉(zhuǎn)：患兒臨床癥狀明顯減輕，體溫恢復(fù)正常，胸部X射線檢查顯示肺部病變基本或大部分吸收；無效：遷延難愈者或死亡者?？傆行剩?）＝（治愈+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較用t檢或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒性肺炎患兒血清miR-24 mRNA、YKL-40表達(dá)水平

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組血清miR-24 mRNA和YKL-40表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組血清miR-24 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組低，而YKL-40含量較對(duì)照組高。見表2。

表2 兩組血清miR-24 mRNA、YKL-40蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

表2 兩組血清miR-24 mRNA、YKL-40蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

組別 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）對(duì)照組 30 1.00±0.18 21.17±6.43實(shí)驗(yàn)組 117 0.83±0.15 66.59±17.48 t值 5.309 13.964 P值 0.000 0.000

2.2 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA、YKL-40表達(dá)水平

不同年齡、性別、肺炎類型、病毒類型及是否合并細(xì)菌感染患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)或方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。重癥與輕癥患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重癥肺炎患兒血清miR-24 mRNA相對(duì)表達(dá)量較低，而YKL-40含量較高。見表3。

2.3 病毒性肺炎患兒的臨床轉(zhuǎn)歸

經(jīng)治療后，73例患兒治愈出院，26例患兒出院時(shí)胸部X射線檢查顯示仍有極少部分病變未吸收，14例患兒遷延難愈，4例患兒死亡。

2.4 病毒性肺炎患兒治療前后血清miR-24 mRNA、YKL-40表達(dá)水平的變化

病毒性肺炎患兒不同預(yù)后組治療前后血清miR-24 mRNA和YKL-40的差值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；遷延難愈組低于痊愈組和好轉(zhuǎn)組（P＜0.05），好轉(zhuǎn)組低于痊愈組（P＜0.05）。見表4。

表3 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

表3 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

臨床病理特征 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）年齡2～＜7歲 85 0.81±0.17 66.12±16.53 7～11歲 32 0.86±0.15 68.73±17.09 t值 1.462 0.754 P值 0.146 0.452性別男74 0.84±0.16 67.34±17.41女43 0.83±0.15 65.59±16.93 t值 0.333 0.530 P值 0.739 0.598肺炎類型支氣管肺炎 59 0.84±0.13 64.42±18.49毛細(xì)支氣管肺炎 35 0.81±0.15 67.21±18.19間質(zhì)性肺炎 19 0.84±0.14 67.05±16.92其他 4 0.79±0.14 65.17±17.12 F值 0.492 0.215 P值 0.689 0.886臨床病理特征 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）臨床診斷輕癥 81 0.88±0.13 54.23±14.80重癥 36 0.72±0.17 81.71±10.25 t值 5.572 10.009 P值 0.000 0.000病毒類型流感病毒 37 0.84±0.12 65.87±17.11呼吸道合胞病毒 31 0.87±0.16 68.26±17.85副流感病毒 19 0.81±0.15 64.53±16.80腺病毒 12 0.82±0.14 63.21±14.98巨細(xì)胞病毒 11 0.81±0.14 65.69±16.76 EB病毒 7 0.83±0.13 66.74±18.25 F值 0.602 0.204 P值 0.699 0.960合并細(xì)菌感染是52 0.80±0.13 67.85±17.63否65 0.85±0.16 65.43±16.84 t值 1.823 0.757 P值 0.071 0.451

表4 不同預(yù)后患兒治療前后血清miR-24 mRNA和YKL-40的差值比較

2.5 病毒性肺炎患兒治療前血清miR-24 mRNA、YKL-40與肺功能的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，治療前患兒外周血清miR-24 mRNA與YKL-40呈負(fù)相關(guān)（r=-0.297，P=0.000），與tPTEF/tE呈正相關(guān)（r=0.422，P=0.000）；另外血清YKL-40與tPTEF/tE呈負(fù)相關(guān)（r=-0.394，P=0.000）。見圖1。

圖1 病毒性肺炎患兒治療前血清miR-24 mRNA、YKL-40與肺功能的相關(guān)性

3 討論

兒童肺炎是各個(gè)地區(qū)兒童醫(yī)院的常見疾病，尤其是在學(xué)齡前兒童中的致死率較高。本研究患兒經(jīng)院內(nèi)治療后，4例死亡，均為＜5歲兒童。病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、軍團(tuán)菌等是引起肺炎的主要病原體。相較于細(xì)菌和非典型性病原體，病毒感染與年齡、季節(jié)、地域關(guān)系密切，易爆發(fā)大面積流行。本研究主要納入浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院冬、春季節(jié)發(fā)病的病毒性肺炎患兒，其中以流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒感染最多見。早期進(jìn)行病原體檢測(cè)可以為臨床治療提供可靠的依據(jù)。但是由于病毒性感染和細(xì)菌性感染多具有重疊性，臨床癥狀不典型，依靠血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原等作為疾病診斷指標(biāo)的特異性較低，更不適用于對(duì)疾病嚴(yán)重程度、臨床療效和預(yù)后的評(píng)估[8]。病毒性肺炎起病急、進(jìn)展迅速、易引發(fā)并發(fā)癥，尋找有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)指標(biāo)用于反映疾病進(jìn)展和療效，具有十分重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值。

YKL-40是20年前由JOHANSEN 等[9]發(fā)現(xiàn)的一類分泌型糖蛋白，由GHI3L1 基因編碼，屬于GH18殼多糖酶家族成員。與其他GH18 殼多糖酶蛋白分子不同，YKL-40 僅具有殼質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，不具有殼質(zhì)酶的生物學(xué)活性，反而在氣道炎癥性疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。GOMEZ 等學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)，YKL-40 在哮喘患者血清中的含量明顯升高，并且與疾病進(jìn)展有關(guān)。JAMES 等學(xué)者[11]也發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病患者血清YKL-40含量也大大增加，并且可作為疾病嚴(yán)重程度、氣道反應(yīng)性及氣流限制性的評(píng)估指標(biāo)。YKL-40 具有與細(xì)菌甲殼質(zhì)酶高度同源性的氨基酸序列，可結(jié)合細(xì)菌的甲殼質(zhì)酶，降解細(xì)菌細(xì)胞壁，進(jìn)而抵御細(xì)菌入侵引起炎癥反應(yīng)[12]。目前臨床關(guān)于YKL-40的大多數(shù)研究主要是針對(duì)細(xì)菌感染性炎癥疾病，對(duì)病毒性肺炎的研究尚少。YKL-40 屬于炎癥急性期蛋白，主要來自于活化的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，病毒性肺炎患兒血清YKL-40含量較健康兒童也明顯增加；而且單純病毒性肺炎患兒血清YKL-40含量與合并細(xì)菌感染患兒比較無差異，說明YKL-40 可能不僅與細(xì)菌感染有關(guān)，而且是肺功能病變過程中的功能性因子。另外，由于YKL-40與C反應(yīng)蛋白和降鈣素原等因子類似，都屬于非特異性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在感染早期即迅速升高，當(dāng)感染被控制后又迅速降低，因此YKL-40 并非是病毒性肺炎的特異性指標(biāo)，但是在預(yù)測(cè)其疾病嚴(yán)重程度時(shí)具有一定的參考價(jià)值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎患兒血清YKL-40含量升高更明顯，而經(jīng)抗病毒、抗感染等綜合治療后，治愈和好轉(zhuǎn)患兒血清YKL-40含量顯著降低，這也間接證實(shí)YKL-40 可能通過某些因子的影響，參與肺組織功能損傷。TANG 等[13]發(fā)現(xiàn)，YKL-40 可以通過MAPK/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8 等促炎因子，并促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖活性。王定淼等學(xué)者[14]也證實(shí)，血清和肺泡灌洗液中YKL-40含量與重癥肺炎患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并且是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究證實(shí)，血清YKL-40與患兒tPTEF/tE 呈負(fù)相關(guān)。由于很多年齡較小的患兒往往不能配合肺功能檢查，而且很多指標(biāo)也不完全適用于兒童，因此采用潮氣肺功能檢查患兒tPTEF/tE，tPTEF/tE 也是評(píng)估肺功能的良好指標(biāo)之一。

除此以外，循環(huán)miRNA 診斷標(biāo)志物的篩查和挖掘一直是臨床研究的熱點(diǎn)。一方面循環(huán)miRNA 多具有穩(wěn)定的保守序列，操作方便，敏感性較高；另一方面，從作用網(wǎng)絡(luò)分析，多數(shù)miRNA 往往是編碼蛋白基因的上游分子，其異常表達(dá)出現(xiàn)的時(shí)間往往早于蛋白分子，因此筆者通過miWalk、TargetScan6.2、PicTar等數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-24和CHI3L1 具有靶向調(diào)控關(guān)系。本研究中血清miR-24 mRNA與YKL-40 呈負(fù)相關(guān)，而且與患兒病情嚴(yán)重程度、肺功能及預(yù)后也有一定的關(guān)系。LIN 等學(xué)者[15]通過脂多糖誘導(dǎo)新生大鼠肺損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血清miR-24 在肺損傷大鼠模型中降低，而上調(diào)miR-24的表達(dá)可明顯抑制肺部損傷和炎癥因子的分泌，這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，基于當(dāng)前臨床對(duì)病毒性肺炎疾病進(jìn)展、臨床療效的評(píng)價(jià)主要依靠癥狀學(xué)依據(jù)，缺乏客觀、量化的標(biāo)志分子，本實(shí)驗(yàn)通過分析血清miR-24 mRNA和YKL-40 在不同臨床病理特征及治療前后表達(dá)水平的變化，證實(shí)兩者與兒童病毒性肺炎有一定的聯(lián)系。其中，血清miR-24 mRNA與患兒肺功能指標(biāo)tPTEF/tE 呈正相關(guān)，而YKL-40與tPTEF/tE 呈負(fù)相關(guān)。檢測(cè)血清miR-24 mRNA和YKL-40表達(dá)水平有助于評(píng)估病情和臨床療效，從而為臨床治療提供依據(jù)。