祁 彧，張艷榮，張 弛，張衛(wèi)珂

（太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原030024）

磷是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一。土壤磷以無(wú)機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)存在，其中有效磷占土壤全磷量的25%～70%左右［1］。隨著常規(guī)磷肥的盲目使用、水土流失及磷酸鹽類(lèi)自身化學(xué)轉(zhuǎn)化，大量磷素以無(wú)效態(tài)儲(chǔ)存，并帶來(lái)了農(nóng)業(yè)的面源污染、水體的富營(yíng)養(yǎng)化及改變土壤生物多樣性等問(wèn)題［2-3］。因此，尋求改良土壤中有效磷的途徑和方法，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境問(wèn)題的改善具有重要意義。磷在堿性土壤中的轉(zhuǎn)化過(guò)程以吸附-解吸為主，其影響因素主要有pH值、鈣、鐵鋁氧化物、有機(jī)質(zhì)等［4］。首先，堿性土壤中因含有大量的HCO-3而具有較高的pH值，并具有較大的緩沖性，對(duì)磷的固定能力很強(qiáng)［5］，土壤pH接近中性時(shí)，磷的有效性才能達(dá)到最高［6］。已有研究表明低分子量有機(jī)酸、酸性物質(zhì)（磷酸二氫銨、硫磺等）和生物酸性肥料均可通過(guò)改變土壤的pH值，對(duì)土壤養(yǎng)分有效性產(chǎn)生影響［7-9］。此外，通過(guò)施用有機(jī)肥料也可促進(jìn)土壤有效磷含量的提高［10-11］。研究證實(shí)，腐殖土可提供大量有機(jī)質(zhì)（以腐殖酸為主），能改善土壤基質(zhì)的疏松度、提高孔隙度，有利于根系擴(kuò)展，還能為微生物活動(dòng)提供碳源［12］。目前市場(chǎng)中生物磷肥占比較少，溶磷微生物種類(lèi)繁多，菌種獲得的難易程度不一［9］，與有機(jī)肥料混合施用方面鮮有報(bào)道?；诖耍疚母鶕?jù)醋酸桿菌具有耐高溫、耐乙醇、高產(chǎn)酸（乙酸），且已在發(fā)酵等行業(yè)廣泛應(yīng)用等特點(diǎn)［13］，將其作為解磷菌種與腐殖土共同施入堿性土壤，通過(guò)土培試驗(yàn)對(duì)比分析二者混合施用與常規(guī)磷肥對(duì)土壤有效磷的影響差異，以期為解決目前磷素利用率偏低及大量流失造成的污染等問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與制備

1.1.1 供試土壤

土壤采樣點(diǎn)選擇呂梁山地區(qū)，該地區(qū)土壤類(lèi)型以褐土為主，采樣深度為0～10cm.經(jīng)測(cè)定樣品pH值為8.5，呈弱堿性，有效磷（AP）和全磷（TP）含量分別為15.82mg／kg、732.41mg／kg.采集后實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在45℃下烘干處理5d，混合過(guò)10目篩備用。

1.1.2 醋酸桿菌菌液（AS）制備

將醋酸桿菌菌種接種至瓊脂培養(yǎng)基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，瓊脂：1.5%，乙醇：3%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；pH：5.5～6.0），30℃下培養(yǎng)36h；之后接種至搖瓶中80mL液體培養(yǎng)基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，KH2PO4：0.45%，乙醇：3%，pH：5.5～6.0），進(jìn)行振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速180r／min，溫度30℃，20h），獲得醋酸桿菌種子液。將巨型球菌屬接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（牛肉膏：0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，瓊脂：2%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；pH：5.5～6.0），30℃下培養(yǎng)48h；之后接種至80mL肉湯液體培養(yǎng)基（與肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基一致，但不添加瓊脂）上振蕩培養(yǎng)（180r／min，30 ℃，36h），獲得巨型球菌種子液。將不同種子液加入由植物殘?bào)w、酸堿調(diào)節(jié)劑和水組成的發(fā)酵罐中繼續(xù)室溫發(fā)酵30d得到AS。

1.2 檢測(cè)方法

土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法（GB 9837-88）；有效磷含量采用碳酸氫鈉提取法（NYT 1121.7-2014：7）.

1.3 試劑與儀器

本文中所有試劑均為分析純。碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鉬酸銨、濃硫酸、酚酞、鹽酸、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、2，6-二硝基酚購(gòu)自天津市化學(xué)試劑四廠(chǎng)；磷肥與腐殖土購(gòu)自山西天脊煤化工有限公司，參數(shù)見(jiàn)表1.

表1 磷肥與腐殖土參數(shù)Table 1 Relevant parameters of phosphate fertilizer and humus soil

采用美國(guó)康塔儀器微生物培養(yǎng)箱進(jìn)行醋酸桿菌菌液的制備；UV-2102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯）測(cè)定土壤TP、AP含量；NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)）鑒定菌液中基團(tuán)類(lèi)型。

1.4 土培試驗(yàn)

采用培養(yǎng)罐分裝土壤（210g／罐），共設(shè)計(jì)11組土培樣品，每組3個(gè)平行，取樣時(shí)間分別為1、7、30、60、90d.添加劑延土壤垂向表層（記為0）與3cm（記為3）兩種深度分別施用，試驗(yàn)用量為 HS：400 g／m2（即2.27g／jar）；肥料：40g／m2（即0.23g／jar）；AS：1mL／jar（去離子水稀釋菌液至10mL）.試驗(yàn)過(guò)程中保持土壤含水率在15%左右。樣品分組情況見(jiàn)表2.

表2 土培樣品處理組Table 2 Treatment groups for soil culture samples

2 結(jié)果與討論

2.1 醋酸桿菌菌液表征

2.1.1 FTIR分析

由圖1可知，645cm-1的強(qiáng)吸收為—OH的彎曲振動(dòng)，說(shuō)明溶液中存在醇類(lèi)物質(zhì)，這與埃希氏巨型球菌三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生醇類(lèi)物質(zhì)一致；1 644cm-1與3 300cm-1處的強(qiáng)吸收對(duì)應(yīng)單體酸—CO羰基的強(qiáng)銳峰與羧酸中的—OH的吸收峰［14］，這與醋酸桿菌經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生乙酸、埃希氏巨型球菌經(jīng)呼吸作用產(chǎn)生的低分子量有機(jī)酸物質(zhì)一致。說(shuō)明自制菌液AS中含有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)與醇類(lèi)物質(zhì)。

2.1.2 高通量測(cè)序

在屬水平級(jí)別對(duì)微生物菌液中主要物種（V3-V4區(qū)）進(jìn)行分析（圖2）.

圖1 AS的紅外譜圖Fig.1 FTIR spectrum of AS

圖2 屬水平上菌液中主要rank reads數(shù)目Fig.2 Number of main rank reads in AS at the genus level

由圖2看出，醋酸桿菌菌液中Acetobacter占46.58%，Megasphaera占21.6%，即主要為醋酸桿菌屬與埃希氏巨型球菌屬。以醋酸桿菌為例，其代謝有機(jī)終產(chǎn)物為乙酸［15］。研究證明在堿性土壤環(huán)境下，有機(jī)酸可活化Ca-P中的磷，同時(shí)酸根與鈣離子絡(luò)合，促進(jìn)難溶性磷素的進(jìn)一步釋放［16］。因此本文自制菌液可滿(mǎn)足土培試驗(yàn)解磷要求。

2.2 不同添加劑對(duì)土壤有效磷的影響

以第90d測(cè)定數(shù)據(jù)為例說(shuō)明不同添加劑對(duì)土壤有效磷的影響（圖3）.

圖3 土培實(shí)驗(yàn)第90dAP／TPFig.3 AP／TP for soil culture experiments in ninetieth day

由圖3可知，與空白組相比，不同施肥方式均顯著提高了AP組分的含量。其中HA對(duì)堿性土壤AP的釋放效果較單施常規(guī)磷肥更好（表層處：T2＞T4，3cm處：T3＞T5），即醋酸桿菌菌液與腐殖土共同施用后可有效促進(jìn)土壤磷的釋放。此結(jié)果與二者提供的有機(jī)酸（乙酸、腐殖酸等）有關(guān)。首先，本文中土壤樣品呈弱堿性，在此條件下土壤磷受到鈣的固定，主要以Ca—P的形式存在，占無(wú)機(jī)磷總量的80%以上［17］。已有研究表明，有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)中含有—COOH、—OH等官能團(tuán)，它們?cè)趯?duì)某些肥料產(chǎn)生溶解作用的同時(shí)，通過(guò)占據(jù)土壤中陰離子專(zhuān)性吸附位點(diǎn)，與Ca2＋等離子螯合，降低了磷酸根等陰離子的吸附量，使一些被束縛的磷素得到釋放；且有機(jī)酸的活化能力與其濃度、有效磷含量呈正相關(guān)［18-19］。其次，腐殖酸肥料能夠調(diào)節(jié)土壤的pH值向中性方向發(fā)展，有益于土壤微生物生長(zhǎng)，并激發(fā)其活性；同時(shí)可以有效降低土壤容重，增加土壤孔隙率，改善土壤的物理性質(zhì)，提高有機(jī)質(zhì)和其他速效養(yǎng)分的含量［20］。

此外，由圖3也可看出，大部分施用腐殖土肥料樣品中AP含量呈現(xiàn)出3cm處＞表層，可能原因?yàn)楦惩林械挠袡C(jī)質(zhì)（腐植酸）間相互作用產(chǎn)生的絮狀現(xiàn)象改善了土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，使土壤的透水性提高，徑流減少，剖面養(yǎng)分增加，有利于磷素發(fā)生交換吸附反應(yīng)，從而提高了其在土壤中的移動(dòng)性與有效性［21］。由于本文土培試驗(yàn)設(shè)計(jì)土層厚度較小，施肥深度與均勻度與田間施肥有較大差異，后續(xù)需要根據(jù)實(shí)際農(nóng)田環(huán)境及種植作物等情況進(jìn)一步深入探討。

2.3 施肥時(shí)間對(duì)土壤有效磷的影響

圖4、圖5分別為土壤表層與3cm深處不同肥料施用后AP含量的變化。首先由圖可以看出，T2、T3（腐殖土與醋酸桿菌液）處理組中AP變化趨勢(shì)為0～30d內(nèi)小幅下降，在第30d左右達(dá)到最低值；30d后含量提高，在第90d達(dá)到最大值，較剛施入時(shí)分別 增 加 10.23% （表層）、12.86% （3cm處）；較空白組分別增加38.69%（表層）、37.83%（3cm處），即與空白組相比，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。劉勝亮等［22］通過(guò)將4種可產(chǎn)出乙酸的解磷細(xì)菌（不動(dòng)桿菌、腸桿菌等）施入土壤后發(fā)現(xiàn)，土壤pH值在30～120d內(nèi)呈逐漸降低趨勢(shì)；AP含量在30d時(shí)較第1d有所下降；接種90d后，較60d有明顯增長(zhǎng)，該結(jié)果與本文試驗(yàn)結(jié)論基本一致。

圖4 施肥時(shí)間對(duì)表層處（T1、T2、T4、T6）土壤有效磷的影響Fig.4 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T4，T6）

圖5 施肥時(shí)間對(duì)土層3cm處（T1、T3、T5、T7）有效磷的影響Fig.5 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T5，T7）

另外，T4-T7組AP含量在磷肥剛施入土壤時(shí)（0d）達(dá)到最大，之后基本處于下降趨勢(shì)。在第90 d時(shí)，不同處理組各層AP含量關(guān)系為T(mén)2＞T6＞T4＞T1（表層）、T3＞T5＞T7＞T1（3cm），即 HA處理方式對(duì)土壤中難溶性磷的溶解優(yōu)于常規(guī)磷肥。該現(xiàn)象反映出土壤單純施用磷肥后，肥料磷更多地被土壤吸附，降低了磷素的有效利用，造成資源浪費(fèi)［23］。

圖6、圖7中T8-T11曲線(xiàn)變化規(guī)律同T4-T7，即將磷肥與HA混合施用后，土壤AP含量在90d內(nèi)基本處于下降趨勢(shì)。不同之處在于0～90d范圍內(nèi)，T8-T11處理組在土壤各層AP含量均要高于HA處理組，說(shuō)明外源磷素的引入使土壤TP含量增加，HA中有機(jī)質(zhì)組分能進(jìn)一步促進(jìn)磷肥中的磷素解吸，從而提高了AP的含量。由此可以證明，在磷素水平較低的堿性土壤中，可同時(shí)施加HA與磷肥，使各形態(tài)磷素含量提高［24］。

此外，圖4-圖7中也顯示出無(wú)論單獨(dú)還是混合HA后施用硝酸磷鉀肥對(duì)于AP含量的提高都優(yōu)于硝酸磷肥，原因可能為肥料中更多的K＋（KCl、K2SO4）及NH＋對(duì)土壤固相表面H＋的交換作用，使土壤pH值下降，從而顯著增加了AP的含量［17］。

圖6 施肥時(shí)間對(duì)表層處（T1、T2、T8、T10）土壤有效磷的影響Fig.6 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T8，T10）

圖7 施肥時(shí)間對(duì)土層3cm處（T1、T3、T9、T11）有效磷的影響Fig.7 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T9，T11）

3 結(jié)論

為了探討腐殖土與解磷微生物協(xié)同作用下對(duì)堿性土壤有效磷（AP）的影響，本文共設(shè)計(jì)了11組土培對(duì)比試驗(yàn)（90d）.結(jié)果顯示，HA（腐殖土＋醋酸桿菌菌液混合施用）對(duì)AP的改善優(yōu)于常規(guī)磷肥；在磷素匱乏土壤中，HA與常規(guī)磷肥混合施用更有利于促進(jìn)AP含量的提高。推測(cè)HA對(duì)AP的影響機(jī)理為：腐殖土富含有機(jī)質(zhì)（以腐殖酸為主），在改善土壤質(zhì)地的基礎(chǔ)上，能為菌液中微生物的代謝活動(dòng)提供碳源；而醋酸桿菌等菌種能產(chǎn)生出低分子量有機(jī)酸，可與腐殖酸共同作用，有效降低堿性土壤的pH值，使土壤磷的形態(tài)發(fā)生改變，促進(jìn)難溶磷的溶解。下一步研究可采用更多種類(lèi)有機(jī)肥料，并結(jié)合田間試驗(yàn)，使結(jié)論更具普遍性。