彭文書(shū)曾胤劉聰龔?fù)瘳搰?yán)亮季愛(ài)兵③

(1滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院云南普洱665000;2普洱茶研究院云南普洱665000)

普洱咖啡香氣濃郁，口感醇厚，油脂豐富，有較愉悅的果酸味［1］。小?？Х犬a(chǎn)業(yè)是云南省發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)和精準(zhǔn)扶貧的重點(diǎn)內(nèi)容，其中普洱市小?？Х冗m宜性最好［2-3］。鑒于咖啡在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的重要地位和種植過(guò)程中技術(shù)升級(jí)、創(chuàng)新的迫切要求，積極培育咖啡樹(shù)新品種無(wú)疑會(huì)推動(dòng)咖啡產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展［4］。茶屬于杜鵑花目山茶科山茶屬（Camellia sinensis）多年生木本植物，而咖啡屬于龍膽目茜草科（Rubiaceae）一種多年生常綠灌木或小喬木［5］。遠(yuǎn)緣嫁接一般指種間、屬間、科間等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物之間的相互嫁接［6］，因此，茶與咖啡的嫁接屬于跨目遠(yuǎn)緣嫁接。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嫁接可以提高植物株型、生產(chǎn)力和抗逆性等。云南省采用嫁接技術(shù)進(jìn)行茶樹(shù)選種、良種繁育、更新?lián)Q種，嫁接后茶葉產(chǎn)量增加，而且嫁接可以降低育種的時(shí)間和費(fèi)用［7］。董云萍等［8］采用大粒種（查理種）為砧木、中粒種‘熱研3號(hào)’為接穗進(jìn)行種間嫁接，發(fā)現(xiàn)嫁接后咖啡米的粒徑增大，而化學(xué)組分含量和杯品品質(zhì)無(wú)改變。楊維時(shí)［9］利用同屬不同種不含咖啡堿的油茶為砧木嫁接茶樹(shù)，選育低咖啡堿茶樹(shù)品種。不同嫁接技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于作物育種和品種改良。

利用嫁接技術(shù)對(duì)山茶科的優(yōu)良茶樹(shù)種和茜草科的優(yōu)良咖啡樹(shù)種進(jìn)行融合，可為篩選和培育兼具茶樹(shù)和咖啡樹(shù)兩種優(yōu)良性狀的“咖啡茶”樹(shù)新品種奠定基礎(chǔ)。此外，由于茶葉和咖啡中也含有一些對(duì)人體健康不利的物質(zhì)，例如茶葉中含有一些導(dǎo)致肝毒性的物質(zhì)；而咖啡豆中含有咖啡白醇和咖啡醇可以導(dǎo)致血清膽固醇升高，誘發(fā)心肌梗死。通過(guò)培育“咖啡茶”新品種，可望能夠富集茶葉和咖啡中的健康元素，規(guī)避兩者的有害物質(zhì)。因此，該項(xiàng)目還將有利于云南茶和咖啡產(chǎn)品的優(yōu)化和升級(jí)、更新?lián)Q代。

試驗(yàn)地點(diǎn)和材料選取可直接影響嫁接的成活率。本次試驗(yàn)在云南省普洱市茶葉科學(xué)研究所（原茶樹(shù)良種場(chǎng)）開(kāi)展，場(chǎng)地中的空氣相對(duì)濕度達(dá)75%。而普洱市屬于高海拔地區(qū)，光照強(qiáng)度大，應(yīng)選用可大幅度降低光照強(qiáng)度的遮陰網(wǎng)。砧木取自5年生茶樹(shù)和5年生咖啡樹(shù)，接穗均為當(dāng)年生春梢［10］。

1 材料與方法

1.1 材料

茶氨酸（純度99.7%，美國(guó)sigma公司）、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；萘乙酸NAA（百奧萊博）、快活林傷口愈合劑（河南中威高科技化工有限公司），咖啡樹(shù)砧木（Iron PickupCoffee）、茶接穗（C.sinensis var.assamica cv.Duanjiebaihao）。

1.2 方法

1.2.1 咖啡樹(shù)砧木嫁接茶接穗［11-12］

1.2.1.1 咖啡樹(shù)為砧木的劈接法（切接法）

2017年1月份，開(kāi)展以咖啡樹(shù)為砧木嫁接茶穗試驗(yàn)。選擇5年左右咖啡樹(shù)作為砧木，選擇50穗生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、半木質(zhì)化當(dāng)年生春梢茶樹(shù)枝條為接穗。其中，30穗作為對(duì)傳統(tǒng)嫁接法嫁接，標(biāo)記為A-1；10穗采用100滋g/mL NAA浸泡1 h，標(biāo)記為A-1a；10穗使用植物傷口愈合劑（植物傷口愈合劑［13］即醫(yī)用膠水）涂抹，標(biāo)記為A-1b，操作方法：在嫁接前，將其均勻涂抹在接穗及砧木楔面上。

2018年采用異穗并接法和組織黏膠粘合法試驗(yàn)，以茶樹(shù)40穗枝條為接穗，其中，10穗采用異穗并接法嫁接，標(biāo)記為B-1；10穗用組織黏膠異穗并接法，標(biāo)記為B-1a；10穗使用單穗嫁接法，標(biāo)記為B-2；10穗使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法，標(biāo)記為B-1c。

2019年汲取了上兩年的經(jīng)驗(yàn)并查閱大量文獻(xiàn)資料后，采用傳統(tǒng)法、同株不同穗套袋法和植物生長(zhǎng)激素（NAA、IAA）處理法進(jìn)行嫁接試驗(yàn)，以茶樹(shù)180穗枝條為接穗。傳統(tǒng)方法記為C-1，同株不同穗法標(biāo)記為D-1，同株不同穗套袋法標(biāo)記為t，用生長(zhǎng)激素NAA處理記為a，用生長(zhǎng)激素IAA處理記為b?？Х日枘九臃ㄒ?jiàn)圖1。

圖1咖啡砧木劈接法

1.2.1.2 咖啡樹(shù)為砧木芽接法

2017年將傳統(tǒng)芽接法標(biāo)記為A-2；用100滋g/mL NAA浸泡1 h，標(biāo)記為A-2a；10穗使用植物傷口愈合劑涂抹，標(biāo)記為A-2b。2018年芽接法的處理：10穗采用異穗并接法嫁接，標(biāo)記為B-2；10穗采用組織黏膠異穗并接法粘合法，標(biāo)記為B-2a；10穗使用單穗嫁接法，標(biāo)記為B-2b；10穗使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法，標(biāo)記為B-2c。2019年傳統(tǒng)方法標(biāo)記為C-2，同株不同穗法標(biāo)記為D-2，同株不同穗套袋法標(biāo)記為t，用生長(zhǎng)激素NAA處理標(biāo)記為a，用生長(zhǎng)激素IAA處理標(biāo)記為b?？Х日枘狙拷臃ㄒ?jiàn)圖2。

1.2.1.3 咖啡嫁接咖啡

2017年至2019年3年間都利用5年左右咖啡樹(shù)為砧木，咖啡樹(shù)枝芽為接穗，采用劈接法（切接法）標(biāo)記為E-1，芽接法標(biāo)記為E-2，各嫁接10穗，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 靠接［14］

1.2.2.1 咖啡與茶樹(shù)靠接

圖2咖啡砧木芽接

用5年以上根系發(fā)達(dá)、粗度基本一致的短節(jié)白毫和鐵皮卡作為靠接材料，每處理各設(shè)置5株樹(shù)（后5個(gè)處理均是靠接2株）。劈接法（切接法）標(biāo)記為D-1，芽接法標(biāo)記為D-2，各嫁接10穗，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。靠接20 d后檢查其成活率，如未成活及時(shí)補(bǔ)接?？Х扰c茶樹(shù)靠接見(jiàn)圖3。

圖3茶樹(shù)與咖啡靠接

1.2.2.2 靠接茶樹(shù)葉片和咖啡葉片茶多酚和咖啡堿含量的測(cè)定［15］

待靠接嫁接完全愈合后，再把砧木的上部和接穗的下部剪去，生長(zhǎng)1年后，采摘6年生長(zhǎng)葉齡的咖啡和茶的鮮葉，萎調(diào)24 h，微波殺青5 min，60℃烘干制成綠茶；制樣，采用高效液相色譜法（HPLC）分別測(cè)定茶穗、咖啡穗、茶對(duì)照組和咖啡對(duì)照組中茶多酚和咖啡堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 劈接法對(duì)茶樹(shù)（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接組合成活率的影響

2017年選擇50穗茶樹(shù)枝條為接穗，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。以咖啡作為砧木、茶樹(shù)枝條作為接穗，用傳統(tǒng)劈接法進(jìn)行嫁接時(shí)，最長(zhǎng)存活時(shí)間僅為72 d，此時(shí)存活率為3%。使用植物生長(zhǎng)激素（NAA）浸泡的接穗最長(zhǎng)僅存活37 d，此時(shí)存活率為20%。而使用傷口愈合劑的穗條存活時(shí)間較短，22 d時(shí)均死亡。

表1 2017年茶樹(shù)（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2018年茶樹(shù)（接穗）與咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率見(jiàn)表2。以咖啡作為砧木、茶樹(shù)枝條為接穗，采用異穗并接法進(jìn)行嫁接，有3穗存活82 d；單穗嫁接法嫁接的10穗中，存活94 d的有2穗；使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法的10穗存活率最低，存活時(shí)間最短，異穗并接法（組織黏膠）次之。

表2 2018年茶樹(shù)（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2019年茶樹(shù)（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率見(jiàn)表3。傳統(tǒng)方法＋同株不同穗套袋法嫁接中有1穗存活至214 d，存活時(shí)間最長(zhǎng)；其次是傳統(tǒng)方法＋同株不同穗法套袋法＋NAA嫁接、傳統(tǒng)方法＋同株不同穗套袋法＋I(xiàn)AA，均有1穗存活至163 d；再次是傳統(tǒng)方法＋NAA、傳統(tǒng)方法＋I(xiàn)AA，均有1穗存活至101 d；嫁接效果最差是傳統(tǒng)嫁接法，僅有2穗存活至81 d。

表3 2019年茶樹(shù)（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2.2 芽接法對(duì)茶樹(shù)（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接組合成活率的影響

2017年芽接法與穗接法處理相同，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。以咖啡作為砧木、茶樹(shù)枝條作為接穗進(jìn)行芽接法時(shí)，傳統(tǒng)芽接法的存活時(shí)間最長(zhǎng)，5穗存活至171 d，此時(shí)存活率為50%；其次是植物生長(zhǎng)激素浸泡（NAA，100滋g/mL，1 h）的芽接法，有1穗存活至141 d，此時(shí)存活率為10%；嫁接效果最差的是植物傷口愈合劑涂抹法，嫁接50 d時(shí)即全部死亡。

表4 2017年茶咖互嫁試驗(yàn)咖啡砧木芽接法成活率

2018年茶咖嫁接咖啡砧木芽接法成活率見(jiàn)表5。以咖啡作為砧木、茶樹(shù)枝條作為接穗進(jìn)行芽接法時(shí)，使用單穗嫁接法的存活時(shí)間最長(zhǎng)，有2穗存活至130 d，此時(shí)存活率為20%；其次是異穗并接法，第100天時(shí)存活率為20%，此時(shí)組織黏膠異穗并接法粘合法和醫(yī)用組織膠單穗嫁接法的存活率均為10%。

表5 2018年茶咖互嫁試驗(yàn)咖啡砧木芽接法成活率

2.3 咖啡嫁接咖啡對(duì)成活率的影響

咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率見(jiàn)表6。咖啡互嫁中，芽接法也僅存活了2個(gè)月，劈接法目前有3穗已經(jīng)存活至7個(gè)月，且已經(jīng)長(zhǎng)出新枝。由此可見(jiàn)，芽接法在咖啡互相嫁接中不易存活，應(yīng)適當(dāng)改進(jìn)嫁接方法。

表6咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率

2.4 靠接法對(duì)茶咖互嫁成活率的影響

靠接法，即接穗并不從母體上剪截下來(lái)，而是將用作接穗的植株種在砧木的近旁，把莖干互相靠攏起來(lái)進(jìn)行嫁接，待接穗和砧木完全愈合后再把砧木的上部和接穗的下部剪去。試驗(yàn)采用二年生茶樹(shù)和二年生咖啡幼苗三七對(duì)間植（圖3），在同等位置分別切出傷口，然后將茶樹(shù)和咖啡互相綁結(jié)在一起，由于接穗在嫁接時(shí)都未脫離母體，目前茶樹(shù)和咖啡都是存活狀態(tài)，但未見(jiàn)傷口愈合。

2.5 茶樹(shù)與咖啡靠接對(duì)茶多酚與咖啡堿的影響

茶多酚在茶樹(shù)無(wú)嫁接（即茶CK）和咖啡無(wú)嫁接（咖啡CK）中的含量相近，分別是18和17.8 mg/g；而在咖啡為砧木嫁接茶穗（即茶穗）中的含量為10.8 mg/g（圖4），比在咖啡為砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量（15 mg/g）低。茶CK咖啡堿含量為3 mg/g，高于咖啡CK的含量（1.3 mg/g）；茶穗咖啡堿含量為1.6 mg/g，與咖啡穗（1.2 mg/g）相差不多。茶穗嫁接法見(jiàn)圖5。

圖4茶樹(shù)與咖啡靠接對(duì)茶多酚與咖啡堿的影響

圖5茶樹(shù)、咖啡樹(shù)嫁接圖

2.6 靠接后茶樹(shù)與咖啡細(xì)胞形態(tài)差別

2.6.1 嫁接顯微結(jié)構(gòu)

參考陳軍亮等［16-17］的方法，將茶樹(shù)、咖啡樹(shù)木質(zhì)化莖做成石蠟切片（圖6），對(duì)與嫁接有關(guān)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩者的形成層在形態(tài)學(xué)上差異較大。將茶樹(shù)與咖啡的嫩莖制成石蠟切片（圖7～8），結(jié)果表明兩者在分生組織處的結(jié)構(gòu)差異較大。遠(yuǎn)緣嫁接的新生嫩莖比原生嫩莖的細(xì)胞強(qiáng)度差，細(xì)胞腔間隙大；嫁接點(diǎn)部位的薄壁細(xì)胞分裂形成大量愈傷組織，通過(guò)愈傷組織的形成，使砧木與接穗在接口處愈合；接入砧木內(nèi)的接穗部分，外圍的薄壁組織恢復(fù)分裂，形成大量的增生組織。

圖6茶樹(shù)、咖啡樹(shù)木質(zhì)化莖做成石蠟切片

茶樹(shù)的分生組織出現(xiàn)在單側(cè)，而咖啡的分生組織是對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)（圖9～10）。茶樹(shù)嫩莖的形成層變化過(guò)程是由圓形變成葫蘆型，然后長(zhǎng)成橢圓形；咖啡形成層變化過(guò)程是由紡錘形過(guò)度成橢圓形，再形成啞鈴型。這是由于茶樹(shù)葉片或花芽是互生生長(zhǎng)，咖啡葉片或花芽是對(duì)生生長(zhǎng)，這就造成兩者形成分生組織方式有所差異。

圖7咖啡嫩葉石蠟切片100X

圖8咖啡嫩莖石蠟切片100X

2.6.2 靠接后茶樹(shù)和咖啡嫩莖的亞顯微結(jié)構(gòu)

圖9靠接莖冷凍切片（左為咖啡莖，右為茶樹(shù)莖）

圖10靠接莖愈合點(diǎn)冷凍切片（左為茶樹(shù)，右為咖啡樹(shù)）

電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，咖啡嫩莖（圖11）表面有少量類(lèi)似臘質(zhì)物質(zhì)覆蓋，而茶樹(shù)嫩莖則無(wú)；但茶樹(shù)嫩莖表面（圖12）有大量長(zhǎng)度大約100～200滋m的茸毛細(xì)胞，咖啡嫩莖表面光滑。亞顯微結(jié)構(gòu)顯示，茶與咖啡的形成層厚度有較大差異，觀察2種植物的導(dǎo)管（圖13～14）發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)與咖啡樹(shù)的導(dǎo)管組織在亞顯微結(jié)構(gòu)中都呈螺紋狀。

圖11咖啡嫩莖表皮冷凍電鏡

圖12茶嫩莖表皮冷凍電鏡

圖13靠接后咖啡莖電鏡切片

圖14靠接后茶莖電鏡切片

3 討論

2017～2019年，共開(kāi)展3輪次的茶樹(shù)、咖啡遠(yuǎn)緣嫁接試驗(yàn)，咖啡樹(shù)作為砧木、茶樹(shù)為接穗的劈接法，一共有10穗枝條相繼發(fā)芽，到目前為止，僅有一株保持生物活性超過(guò)10個(gè)月（2020年2月），多數(shù)都不超過(guò)6個(gè)月。芽接法均沒(méi)有出現(xiàn)發(fā)芽植株?？Х燃藿涌Х仍囼?yàn)中，2017年存活率較低，2018年無(wú)存活植株，2019年存活率都在70%以上。試驗(yàn)結(jié)果表明，嫁接常與季節(jié)有關(guān)，2018年嫁接較晚，成活率低；芽接法常不如穗接法存活率高；套袋可有效提高嫁接的成活率；生長(zhǎng)激素對(duì)嫁接的成活率有一定的影響，但在本試驗(yàn)中表現(xiàn)不明顯；植物傷口愈合劑和醫(yī)用組織黏膠（膠水）對(duì)植物嫁接無(wú)影響。

植物顯微結(jié)構(gòu)也表明，茶樹(shù)與咖啡樹(shù)在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有差異。本研究也對(duì)靠接試驗(yàn)植株進(jìn)行分離處理，結(jié)果表明，2株植物接觸面仍容易完整分離，兩者并沒(méi)有粘合，都已木質(zhì)化并各自長(zhǎng)出愈傷組織，僅是通過(guò)外界物理作用力勉強(qiáng)結(jié)合在一起，兩者結(jié)合部位已出現(xiàn)畸形生長(zhǎng)。對(duì)靠接植株葉片茶多酚進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，茶多酚在茶CK和咖啡CK中含量相近，而在咖啡為砧木嫁接茶穗（即茶穗）中含量比咖啡為砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量低?？Х葔A在茶CK中含量高于咖啡CK，在茶穗和咖啡穗中含量相差不多。

嫁接是一項(xiàng)勞動(dòng)技能，嫁接成功與否常與勞動(dòng)者的操作熟練程度有很大關(guān)系。2017年嫁接存活率低可能與嫁接工人操作水平有一定相關(guān)性。2018年聘請(qǐng)了熟練工人嫁接，采用老枝封蠟，由于嫁接季節(jié)較晚，導(dǎo)致成活率也較低［18］。2019年總結(jié)了2次經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)年正常嫁接的成活率約90%，遠(yuǎn)緣嫁接新發(fā)芽植株也較多；多數(shù)新發(fā)芽植株長(zhǎng)至二葉期時(shí)，就出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，隨后枝條又重新長(zhǎng)出枝條，僅有一兩株能長(zhǎng)出枝條，但不能木質(zhì)化；新長(zhǎng)出枝條明顯出現(xiàn)干癟，與正常枝條明顯不同。

組織黏膠不僅能夠在組織液陰離子的作用下能快速聚合固化成膜，并與楔面鑲嵌緊密，牢固地保持傷口的對(duì)合狀，促進(jìn)愈合，還能夠?qū)⒔M織和細(xì)菌隔離，具有抗感染和保護(hù)創(chuàng)面的作用，同時(shí)還具有組織液中陰離子的作用。

綜合3個(gè)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)與咖啡樹(shù)分屬于不同的科、目，且植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特點(diǎn)相差甚大，屬于遠(yuǎn)緣嫁接的植物育種，其變異率比近緣嫁接高［19］，而成活率一般比較低［20］，所以，本研究到目前為止，一直未能嫁接成活，試驗(yàn)具有極大的挑戰(zhàn)性。砧木和接穗不親和，不能生長(zhǎng)愈傷組織，導(dǎo)致輸導(dǎo)組織不能聯(lián)通，生長(zhǎng)物質(zhì)引起導(dǎo)管或篩管阻塞，不能進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換。根據(jù)茶氨酸和咖啡堿的含量可以判斷茶葉的品質(zhì)［21］，從靠接后茶多酚和咖啡堿含量來(lái)看，靠接后茶多酚和咖啡堿含量均有所降低，這與靠接后植物間發(fā)生了物質(zhì)交換有關(guān)。

下一步研究應(yīng)結(jié)合先進(jìn)的生態(tài)學(xué)理論和技術(shù)實(shí)現(xiàn)茶與咖啡遠(yuǎn)緣嫁接技術(shù)的突破，并對(duì)嫁接過(guò)程中出現(xiàn)的嫁接不親和情況進(jìn)行分析，從分子水平上探索遠(yuǎn)緣嫁接親和與不親和的機(jī)理，可為利用茶樹(shù)、咖啡相互嫁接選育新品種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。