葉錦培 陳仕香 唐世斌 黃欣宇 黃愛萍 黎敏芝 李曉麗

摘要：于25 ℃（CK）、15 ℃和5 ℃條件下，水培六堡茶茶苗1個月后，測定葉片中MDA含量，CAT、SOD、POD活性及DNA甲基化水平。結(jié)果表明，溫度從25 ℃降到5 ℃時，六堡茶茶苗MDA含量、CAT活性和DNA甲基化水平呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢，15 ℃時高于對照組，表明適當(dāng)?shù)蜏貙DA含量、CAT活性和DNA甲基化水平有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時，則會對其有一定的抑制作用;SOD、POD活性呈現(xiàn)“高-低-高”的趨勢，15 ℃時低于對照組，5 ℃時高于對照組，表明適當(dāng)?shù)牡蜏貙OD、POD活性有一定的抑制作用，而隨著溫度繼續(xù)降低則會對其有促進(jìn)作用。研究結(jié)果有利于了解六堡茶的抗寒機(jī)理，并為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：溫度;脅迫;抗性生理;DNA甲基化;六堡茶

中圖分類號：S571.101;TS272

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0164-04

在生長過程中，植物可能會遇到各種環(huán)境脅迫。植物處在逆境狀態(tài)下，其體內(nèi)的活性氧會大量積累，導(dǎo)致其不能正常生長，甚至死亡。植物體內(nèi)的保護(hù)酶可以清除過量的活性氧，維持其動態(tài)平衡。保護(hù)酶CAT（過氧化氫酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過氧化物酶）在植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用。低溫誘導(dǎo)下抗氧化酶基因表達(dá)提高，增強(qiáng)了這些抗氧化酶的活性以維持植物體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，增強(qiáng)植物對低溫的抗性。同時，脅迫下植物葉片中MDA含量也會增大，膜脂過氧化加劇，膜透性增強(qiáng)。

DNA甲基化是植物生長發(fā)育中普遍存在的一種現(xiàn)象。研究植物DNA甲基化與環(huán)境脅迫之間的關(guān)聯(lián)，可為環(huán)境脅迫對植物生長發(fā)育的影響提供理論基礎(chǔ)，為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展提供指導(dǎo)。

六堡茶因最早產(chǎn)自于廣西梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名[1]，其生產(chǎn)歷史悠久，被列為全國二十四名茶之一[2]。20世紀(jì)50年代，六堡茶主導(dǎo)香港市場，后熱銷東南亞[3]。近年來，隨著黑茶的消費(fèi)熱潮，六堡茶的年產(chǎn)量和出口量均出現(xiàn)快速增長[4]。六堡茶的區(qū)域品牌價值在黑茶類中一直穩(wěn)居前列，梧州市政府出臺多項政策措施扶持六堡茶的健康可持續(xù)發(fā)展。

六堡茶原產(chǎn)地廣西梧州地處北回歸線以南，氣候溫暖濕潤，因此六堡茶對于低溫的適應(yīng)性相對較弱，特別是2008年的雨雪冰凍災(zāi)害席卷全國，六堡茶產(chǎn)區(qū)也不能幸免。隨著全球變暖，近年來極端天氣和氣候事件頻繁發(fā)生，探討六堡茶對低溫的抗性以及遭受低溫時的生理生化變化，對于六堡茶的選育和栽培乃至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。本研究通過在不同溫度環(huán)境下對六堡茶茶苗進(jìn)行水培，探討低溫脅迫下六堡茶茶苗的抗性生理和DNA甲基化水平差異，不僅可揭示六堡茶的抗寒機(jī)理，同時為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本次試驗材料選自廣西蒼梧縣國有天洪嶺林場六堡茶六堡群體種扦插苗，所選茶苗長勢大體一致（苗高約30 cm）。把茶苗根系土壤洗凈后放入盛有1 L 1/2Hoagland營養(yǎng)液的水桶中水培，使茶苗適應(yīng)水培環(huán)境，期間每周更換營養(yǎng)液。水培1個月后，將茶苗分別置于全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置3個處理，分別為5 ℃、15 ℃和25 ℃（CK），每處理3個重復(fù)水桶，每個水桶放置茶苗11株。在恒溫條件下培養(yǎng)1個月，每周更換營養(yǎng)液。每日光照時間為12 h（07：00—19：00），光照度為7 500 lx。各處理1個月后，茶苗都長出嫩葉，采集枝條頂部新長出的2～3張嫩葉和芽保存在4 ℃低溫下用以測定生物指標(biāo)。

1.2 抗性生理指標(biāo)測定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒提取MDA、CAT、SOD和POD，提取步驟參照試劑盒說明書。采用TBA法測定MDA含量，采用可見光法測定CAT、POD活性，采用羥胺法測定SOD活性。

1.3 DNA甲基化水平

1.3.1 DNA提取 六堡茶茶苗葉片基因組DNA的提取采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的新型植物基因組DNA試劑盒，提取步驟參照試劑盒說明書，提取的DNA保存于-20 ℃下。取10 μL DNA提取液，采用紫外分光光度計測定D260 nm和D280 nm，以D260 nm估算DNA產(chǎn)率，D260 nm/D280 nm判斷DNA樣品純度。

1.3.2 DNA甲基化水平測定 六堡茶茶苗葉片DNA中5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的測定主要參照黑淑梅等的方法[5]，首先配制好2 mol/L HCl溶液和 4 mol/L NaOH溶液各1 L。移取上述DNA溶液 20 μL于1.5 mL離心管中，再吸取20 μL 2 mol/L HCl于其離心管中，于恒溫水浴鍋中80 ℃水解 120 min，水解后吸取20 μL 4 mol/L NaOH于離心管中以中和HCl，4 000 r/min離心分離1 min，移取上清液于新的離心管中，待測5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量。

將50 mg胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶解于500 μL的TE緩沖液中（濃度為100 μg/μL），再取0.75 μL溶于1.5 mL TE緩沖液配制成濃度為50 μg/μL的胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液。5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液也以相同方式制備。

用高效液相色譜法測定六堡茶茶苗DNA甲基化水平。色譜柱：Hypersil BDS-C18鍵合柱（5 μm，150 mm×46 mm）。流動相的組成成分：5%甲醇，4.75 mmol/L己烷磺酸鈉，0.2%三乙醇胺。流動相用娃哈哈純凈水配制，再用磷酸將其pH值調(diào)為5.5。流速：0.7 mL/min。檢測波長：273 nm，進(jìn)樣量：10 μL，運(yùn)行時間：15 min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10 μL，其對應(yīng)的濃度為10、20、30、40、50 μg/μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

六堡茶茶苗葉片DNA的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量，運(yùn)用外標(biāo)準(zhǔn)法計算。先比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，再根據(jù)公式[5-MeC/（C+5-MeC）]×100%計算5-MeC的百分含量。用MS Excel 2007對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對六堡茶茶苗抗性生理的影響

2.1.1 MDA含量 從對照溫度（25 ℃）降到5 ℃時，MDA含量呈現(xiàn)“低—高—低”的趨勢（圖1-A）。對照MDA含量為117.66 nmol/g，15 ℃時MDA含量高于對照組73.07%（203.63 nmol/g），而5 ℃時則低于對照組22.37%（91.34 nmol/g）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙DA有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時，則對MDA有一定的抑制作用。

2.1.2 CAT活性 從對照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時，CAT活性呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢（圖1-B）。對照CAT活性為2.25 U/mg，15 ℃時CAT活性高于對照組64.44%（3.70 U/mg），而5 ℃時則低于對照組19.11%（1.82 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙AT有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時，則對CAT有一定的抑制作用。

2.1.3 SOD活性 從對照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時，SOD活性呈現(xiàn)“高—低—高”的趨勢（圖1-C）。對照SOD活性為1.97 U/mg，15 ℃時SOD活性低于對照組7.11%（1.83 U/mg），而5 ℃時則高于對照組4.06%（2.05 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙OD有一定的抑制作用，溫度為5 ℃時對SOD有促進(jìn)作用。

2.1.4 POD活性 從對照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時，POD活性呈現(xiàn)“高—低—高”的趨勢（圖1-D）。對照POD活性為0.18 U/mg，15 ℃時POD活性低于對照組55.56%（0.08 U/mg），而5 ℃時則高于對照組11.11%（0.20 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙OD有一定的抑制作用，隨著溫度的繼續(xù)降低對POD有刺激作用。

2.2 低溫對六堡茶茶苗DNA 5-甲基化的影響

如圖2-A和2-B，以濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，峰面積（×10 000）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品胞嘧啶的線性方程為y=12 590x+3 212，r2=0.999 6;標(biāo)準(zhǔn)品5-甲基胞嘧啶線性方程為y=37 715x-16 156，r2=0.999 6;說明胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在0～50 μg/μL范圍內(nèi)，分別都有良好的線性關(guān)系。

從對照溫度（25 ℃）降到5 ℃時，六堡茶DNA甲基化水平呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢，如圖3所示。對照組DNA甲基化水平為9.79%，15 ℃時為27.36%，高于對照組179.47%，而5 ℃時為24.14%，高于對照組146.58%。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)牡蜏貙NA甲基化水平有一定刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時，則對DNA甲基化水平有一定的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 低溫脅迫對六堡茶茶苗抗性生理的影響

活性氧是與氧代謝有關(guān)過程的中間產(chǎn)物，其中以自由基形式存在的活性氧會導(dǎo)致植物不能正常生長發(fā)育，加速植物衰老，甚至導(dǎo)致死亡[6]。六堡茶茶苗體內(nèi)的活性氧和活性氧清除系統(tǒng)，在正常情況下能夠保持著動態(tài)平衡。當(dāng)遭受到脅迫時，六堡茶茶苗的光合作用受阻，部分氧氣被作為電子受體形成超氧陰離子自由基（O-2·），其體內(nèi)就會累積超過動態(tài)平衡的活性氧，超越活性氧清除系統(tǒng)的能力范圍，就會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，使六堡茶茶苗的生長受阻。

CAT、SOD和POD是六堡茶茶苗體內(nèi)酶催清除系統(tǒng)中的主要成員。在清除活性氧時，SOD是第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，催化O-2·發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2和水。CAT和POD可以阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過不同的方式把H2O2分解為水和氧氣。六堡茶茶苗體內(nèi)非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并由此形成脂質(zhì)過氧化物，使茶苗組織細(xì)胞受損傷。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，作為膜脂過氧化指標(biāo)，直接反映六堡茶茶苗的受損程度。

本研究表明，隨著溫度降低，MDA含量先呈現(xiàn)上升狀態(tài)，膜脂過氧化程度增大，在15 ℃后開始下降，膜脂過氧化程度減小，說明15 ℃的低溫對六堡茶茶苗的生長有抑制作用，受損程度最大。隨著溫度降低，六堡茶茶苗的CAT活性先增加后降低，SOD和POD則隨著溫度的降低先下降后上升。當(dāng)SOD和POD活性較低時，為了維持活性氧與活性氧清除系統(tǒng)的平衡，CAT活性增大，在維持活性氧平衡中發(fā)揮主要作用。在15 ℃時，SOD和POD活性降低的原因目前尚不明確，推測可能與茶苗對低溫的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)，15 ℃可以導(dǎo)致酶活性的下降但并不足以使SOD和POD在茶苗體內(nèi)高度表達(dá)。同時，SOD、POD活性與MDA含量緊密相關(guān)[7]，MDA是自由基引起的膜脂過氧化的產(chǎn)物，而SOD則是清除自由基的主要抗氧化酶[8]，隨著溫度降低，六堡茶茶苗的MDA含量先升高后降低，SOD活性先下降后升高，兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。低溫抑制了六堡茶茶苗的SOD活性，使活性氧大量積累，MDA含量增大，加大了膜脂過氧化程度，破壞了膜的完整性，使得茶苗葉片不能正常生長，進(jìn)而危害六堡茶茶苗的整體。

3.2 低溫脅迫對六堡茶茶苗DNA甲基化水平的影響

DNA甲基化是六堡茶茶苗調(diào)控其基因表達(dá)的重要手段之一，在低溫馴化過程中，某些與耐寒相關(guān)的基因被激活，從而使六堡茶茶苗適應(yīng)低溫逆境。Choi等的研究表明，低溫脅迫下植物的相關(guān)抗逆基因發(fā)生去甲基化，增加相應(yīng)基因的表達(dá)量來應(yīng)對低溫逆境[9]。因此，低溫（15 ℃和5 ℃）下，六堡茶茶苗為了適應(yīng)低溫而使基因組總體上趨向于去甲基化從而調(diào)控某些耐寒基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了六堡茶茶苗對低溫的適應(yīng)性。周艷華等利用MSAP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低溫處理期間茶樹樣品和低溫處理之后茶樹樣品，其基因組DNA同時發(fā)生甲基化和去甲基化，甲基化水平高于去甲基化水平，因此總體甲基化水平呈現(xiàn)增加趨勢[10]，這與本研究結(jié)果相一致。

低溫脅迫下，六堡茶茶苗DNA甲基化水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，可能是因為溫度從25 ℃降到15 ℃，對甲基轉(zhuǎn)移酶、染色質(zhì)甲基化酶和重新甲基化酶的活性抑制不大，甚至還有所促進(jìn)，從而提高了六堡茶茶苗DNA甲基化水平。當(dāng)溫度進(jìn)一步降低，則抑制了這些參與DNA甲基化酶的活性，從而使六堡茶茶苗的DNA甲基化水平有所降低。

本研究分別于25 ℃、15 ℃和5 ℃下水培六堡茶茶苗，測定葉片中MDA含量，CAT、SOD和POD活性以及葉片中DNA甲基化水平。研究表明，適當(dāng)?shù)蜏貙αげ璨杳缛~片中MDA含量、CAT活性和DNA甲基化水平有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時，則會對其有一定的抑制作用。同時，適當(dāng)?shù)牡蜏貙αげ璨杳缛~片中SOD和POD活性也有一定的抑制作用，而隨著溫度繼續(xù)降低，則會對其有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果不僅可以揭示六堡茶的抗寒機(jī)理，而且可為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]龍志榮，邱瑞瑾，馬士成，等. 六堡茶研究進(jìn)展[J]. 中國茶葉加工，2017（1）：40-45.

[2]龍志榮，馬士成，梅 宇，等. 2013年全國六堡茶產(chǎn)銷形勢分析報告[J]. 茶世界，2013（7）：16-22.

[3]溫志杰，石榮強(qiáng)，何勇強(qiáng)，等. 六堡茶渥堆過程中微生物種群變化的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：1009-1011.

[4]陳小強(qiáng)，葉 陽，成 浩，等. 六堡茶的理化分析研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008（7）：77-80.

[5]黑淑梅. 重金屬鉻對小麥根系DNA甲基化水平的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，37（2）：14-15，26.

[6]陳巧艷，李迎迎，陳劉平，等. 低溫脅迫對不同小麥品種結(jié)實率和活性氧代謝的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（11）：63-65.

[7]王寶山，趙思齊. 干旱對小麥幼苗膜脂過氧化及保護(hù)酶的影響[J]. 山東師大學(xué)報：自然科學(xué)版，1987（1）：29-38.

[8]勾曉華，王勛陵. 氟化氫對植物葉片中SOD酶活力和MDA含量的影響[J]. 西北植物學(xué)報，1995（5）：71-76.

[9]Choi C S，Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of ageneencoding a glycero phosphodie sterase-like protein in tobacco plants[J]. Molecular Genetics and Genomics，2007，277（5）：589-600.

[10]周艷華，曹紅利，岳 川，等. 冷馴化不同階段茶樹DNA甲基化模式的變化[J]. 作物學(xué)報，2015（7）：1047-1055.