劉揚(yáng)揚(yáng) 馬勛 康立超 李紅歡 錢凌霄 江婉琳 阮婷玉

摘要：對食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌LM5567的lmoF2365_0032基因進(jìn)行克隆和序列分析，利用PCR方法對lmoF2365_0032基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，篩選陽性菌株進(jìn)行測序比對分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的lmoF2365_0032基因序列長度為811 bp，克隆得到lmoF2365_0032基因的陽性轉(zhuǎn)化子;生物信息學(xué)分析表明，lmoF 2365_0032蛋白屬于跨膜蛋白，無信號肽序列;二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)占比較大，分別是37.86%和36.89%;序列比對結(jié)果表明，LM5567菌株lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）的相似性均為99.7%;與10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055菌株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性均為99.8%;LM5567 lmoF 2365_0032基因編碼的氨基酸序列與上述菌株相似性均為94.7%。試驗(yàn)成功克隆了lmoF 2365_0032基因，可為進(jìn)一步探究lmoF2365_0032基因功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：食源性單核細(xì)胞增多李斯特菌;lmoF2365_0032基因;PCR;生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0074-05

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocy-togenes，LM）是重要的食源性人獸共患李斯特菌病的胞內(nèi)寄生菌，與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌并稱為世界四大食源性致病菌[1-2]。LM可突破宿主的腸道屏障、血腦屏障和血胎屏障，臨床上引起人和多種動(dòng)物的腦炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及發(fā)熱性胃腸炎等[3]。李斯特菌病具有較高的死亡率，免疫功能不全者、孕婦、新生兒及胎兒都是李斯特菌病的易感群體，該病在動(dòng)物中主要見于牛、羊、駱駝等反芻動(dòng)物[4-5]。因此，它對公共安全和畜牧業(yè)發(fā)展危害極大。

LM基因組中存在多個(gè)毒力因子基因簇，這些基因簇編碼的蛋白在感染機(jī)體過程中發(fā)揮著重要作用。arc基因由4部分組成，分別是arcA、arcB、arcC和arcD，它們分別編碼精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（arginine deiminase system，ADS）中的精氨酸脫亞氨酶（ADI）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲基酶（OTC）、氨甲酸激酶（CK）和精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體[6]。arc基因編碼的蛋白在LM調(diào)節(jié)酸平衡中發(fā)揮重要作用，2016年Maury等對104株不同來源的代表性LM菌株進(jìn)行全基因組序列分析，挖掘出15個(gè)高毒力分離株具備而參考菌株不具備的假定毒力因子基因/基因簇，其中包括精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，但是與以往研究結(jié)果不同的是，編碼精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因除了arcD外，還有3個(gè)未知功能的基因，其中就包括lmoF2365_0032基因[7]。為此，對筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的LM進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)54株食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌中只有19株可以檢測到lmoF 2365_0032基因。arc基因編碼的未知功能的蛋白是否與精氨酸代謝、抗酸應(yīng)激以及毒力有關(guān)，目前尚不清楚。

本試驗(yàn)克隆分析編碼精氨酸/鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的lmoF2365_0032基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步探究食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 單核細(xì)胞增生李斯特菌LM5567菌株分離自新疆農(nóng)墾科學(xué)院;大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 PCR Mix、ddH2O、DL 2 000 DNA Marker，均購自廣州東盛生物科技有限公司;腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基，購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;PCR儀（Bio-Rad MyCycler thermal）;電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD-2000），購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[4]中提供的Gene （Locus tag），運(yùn)用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)編碼LM5567菌株精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的lmoF2365_0032基因的特異性引物，引物序列為5′-TTTGGACCGACTTGATTG-3′（F）、5′-ACCCACAAATGCGATAGA-3′（R），預(yù)期擴(kuò)增片段長度為811 bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和基因組DNA的提取 將LM5567菌株從-80 ℃保存條件下取出，接種于BHI平板上，37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～18 h，采用 1.5 mL 試管收集菌體，參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取LM5567菌株的全基因組DNA，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測 PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 10 μL，加ddH2O至體積20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性40 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃再延伸10 min，共30個(gè)循環(huán);4 ℃保存60 min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測：瓊脂糖凝膠加溴化乙錠（EB）染色，將 10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及DL 2 000 marker上樣后進(jìn)行電泳，電壓為150 V，電流為 50 mA，25 min后在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 目的基因克隆及測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收目的條帶，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體過夜連接，采用冷熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Ampr（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h。篩選出陽性克隆菌，將鑒定的陽性克隆菌送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/ protparam/）分析基因序列的基本理化性質(zhì)，利用SignalP 4.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽;利用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）在線分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu);利用SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 lmoF2365_0032基因PCR擴(kuò)增和克隆測序

利用特異性引物擴(kuò)增lmoF2365_0032基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在811 bp處有單一清晰條帶，與lmoF2365_0032基因擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小一致（圖1）。經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后，將驗(yàn)證為陽性菌的質(zhì)粒提取物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，經(jīng)測序進(jìn)一步驗(yàn)證，成功獲得序列長度為811 bp的lmoF2365_0032基因陽性轉(zhuǎn)化子。

2.2 lmoF2365_0032編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASY在線軟件中編碼ProtParam工具分析LM5567 lmoF2365_0032基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，得出該蛋白理論等電點(diǎn)為8.51，分子量為 22 973.62，原子組成是C1 050H1 685N253O314S3，脂肪系數(shù)是101.75，總疏水性平均數(shù)是-0.124，負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）22個(gè)，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）24個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)是23.31（<40為穩(wěn)定蛋白），屬于穩(wěn)定蛋白。

2.3 lmoF2365_0032編碼蛋白信號肽和跨膜區(qū)分析

利用SignalP 4.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）預(yù)測lmoF2365_0032蛋白質(zhì)的信號肽，結(jié)果（圖2）表明，lmoF2365_0032蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白。利用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）顯示，lmoF2365_0032為跨膜蛋白，跨膜區(qū)位于7～29氨基酸處。

2.4 lmoF2365_0032基因核苷酸序列同源性比對

將測序得到的結(jié)果進(jìn)行序列拼接，得到LM5567菌株的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列，將其與GenBank上公布的6株不同來源的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果（圖4）顯示，LM5567菌株的lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）相似性均為99.7%;與10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性為99.8%。

2.5 lmoF2365_0032基因序列編碼氨基酸同源性比對

利用DNSstar軟件推導(dǎo)出的LM5567菌株lmoF2365_0032基因編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的6株不同來源的lmoF2365_0032基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果（圖5）顯示，LM5567菌株lmoF 2365_0032基因編碼的氨基酸序列與02-6680菌株（4b，奶酪，加拿大）、10-0811菌株（1/2b，螃蟹，加拿大）、10-0809菌株（4b，糞便，加拿大）、81-055菌株（4b，腦脊髓液，加拿大）、02-1103菌株、02-1792菌株（4b，奶酪，加拿大）、81-0861菌株（4b，卷心菜，加拿大）的相似性均為94.7%。

2.6 lmoF2365_0032蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA軟件對LM5567菌株lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含15.53%的α-螺旋（含32個(gè)氨基酸），37.86%的無規(guī)則卷曲（含

78個(gè)氨基酸），36.89%的延伸鏈結(jié)構(gòu)（含76個(gè)氨基酸）和9.71%的β-轉(zhuǎn)角（含20個(gè)氨基酸）（圖6）。通過SWISS-MODEL分析平臺(tái)預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖7），進(jìn)一步驗(yàn)證了二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

3 討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛存于自然界、食品加工各環(huán)節(jié)，能夠耐受高鹽、高滲、高溫、酸性和堿性環(huán)境。其中，在酸性環(huán)境中的存活尤為關(guān)鍵，LM經(jīng)污染的飼草料和食品等進(jìn)入人和動(dòng)物機(jī)體后，首先遭遇的就是胃腸道的低pH值環(huán)境，被巨噬細(xì)胞吞噬后，吞噬體內(nèi)也有一個(gè)酸化過程，過酸環(huán)境不利于該細(xì)菌的存活，因此單核細(xì)胞增生李斯特菌必須具備有效維持pH值平衡的機(jī)制，以保證其在酸性環(huán)境中存活[8]。arc基因編碼的精氨酸脫亞胺基酶系統(tǒng)（ADS）中的蛋白在LM調(diào)節(jié)酸平衡中發(fā)揮重要作用[9]。lmoF2365_0032基因是編碼精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因之一，因此推測其有助于細(xì)菌在酸性條件下存活。

ADS存在于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中。ADS作用的發(fā)揮需要一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和3個(gè)酶，首先由arcD編碼的精氨酸鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞外攝取精氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，接著由arcA編碼的精氨酸脫亞氨酶（ADI）將精氨酸分解為鳥氨酸和氨，鳥氨酸在arcB編碼的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰基酶的作用下生成鳥苷和氨甲酰磷酸鹽，然后由arcC編碼的氨甲酸激酶將氨甲酰磷酸鹽的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷（ADP）產(chǎn)生能量腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）[10]。由此可見，一方面細(xì)菌可通過ADS攝取胞外的精氨酸產(chǎn)生ATP，促進(jìn)細(xì)菌生長繁殖，另一方面當(dāng)細(xì)菌處于酸性環(huán)境時(shí)，ADS產(chǎn)生的氨可與細(xì)胞質(zhì)中的氫離子結(jié)合為銨離子，從而提高細(xì)胞質(zhì)中的pH值，在一定程度上減輕酸應(yīng)激的傷害。

ADS除了在抗酸應(yīng)激中發(fā)揮重要作用外，在許多細(xì)菌的致病性中也具有重要作用。Evans等的沙門菌生長動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明，arcA參與鞭毛的生物合成、趨化因子的基因表達(dá)調(diào)控[11]。Ma等在禽大腸桿菌（APEC）雛鴨模型中發(fā)現(xiàn)，APEC野毒株致死率高于arcA缺失株;與野毒株相比，arcA缺失株腦組織的載菌量大幅度下降，說明arcA基因的缺失可顯著降低APEC在雛鴨模型中的毒力[12]。Thao等通過血清殺傷試驗(yàn)表明，arcA是嗜血桿菌抗血清和逃避補(bǔ)體的必要條件[13]。Gupta等發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌arcD的缺失增強(qiáng)了A549細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，該突變體還表現(xiàn)出莢膜受損，表明arcD不僅可能在抗吞噬中發(fā)揮作用，而且可能參與莢膜的形成[14]。陳健舜等構(gòu)建了李斯特菌10403的arcA、arcB、arcD缺失株，發(fā)現(xiàn)缺失株對Hela細(xì)胞的黏附和侵襲沒有影響，但是會(huì)降低小鼠的脾內(nèi)載菌數(shù)，使半數(shù)致死劑量（LD50）高于親本株，說明arcA、arcB和arcD與細(xì)菌毒力相關(guān)[15]。但食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌lmoF2365_0032蛋白的功能未見相關(guān)報(bào)道。

本研究采用PCR方法從食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌LM5567菌株中克隆了lmoF2365_0032基因，經(jīng)測序、拼接、分析比對得到，lmoF2365_0032基因的全長序列為811 bp。同源性比對分析顯示，LM5567菌株lmoF2365_0032基因的核苷酸序列與4b血清型菌株相似性較高，為99.8%，其次與1/2b血清型菌株相似性為99.7%，其編碼的氨基酸序列相似性為94.7%。LM5567菌株lmoF2365_0032蛋白的理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白是一種偏堿性（等電點(diǎn)理論值為8.51）、穩(wěn)定（不穩(wěn)定指數(shù)為23.31<40.00，為穩(wěn)定性蛋白）、親水性蛋白質(zhì)。lmoF2365_0032蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，該蛋白為跨膜蛋白，無信號肽區(qū)域，屬于非分泌蛋白;lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，lmoF2365_0032蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含15.53%的α-螺旋（含32個(gè)氨基酸），37.86%的無規(guī)則卷曲（含78個(gè)氨基酸），36.89%的延伸鏈結(jié)構(gòu)（含76個(gè)氨基酸）和9.71%的β-轉(zhuǎn)角（含20個(gè)氨基酸），其中以無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)為主;lmoF2365_0032蛋白具有高度親水性，由此推斷該蛋白與抗酸應(yīng)激有關(guān)。

本研究首次克隆了lmoF2365_0032基因，并利用生物學(xué)軟件對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測，為今后研究該蛋白與LM5567菌株致病作用的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

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