楊瑞波 于笛 牟芃玥 劉雪梅 趙少貞

目前，白內(nèi)障仍是我國首位致盲眼病，在所有致盲眼病中約占56.7%[1]。白內(nèi)障患者多為雙眼患病,第一眼白內(nèi)障手術(shù)后,由于雙眼視力及屈光狀態(tài)不一致，患者雙眼視功能會受到影響[2],故越來越多患者短期內(nèi)要求行第二眼白內(nèi)障手術(shù)。但是,臨床中部分短期內(nèi)行第二眼白內(nèi)障手術(shù)的患者常出現(xiàn)術(shù)中眼部疼痛較第一眼加重的現(xiàn)象[2]，導(dǎo)致患者配合能力下降[3]，如眼球運(yùn)動頻繁，后房眼壓升高，甚至出現(xiàn)心率加快、血壓升高、情緒緊張等連帶反應(yīng)，以上情況增加了手術(shù)難度及風(fēng)險(xiǎn)，手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率(如后囊膜破裂、眼壓升高、眼底出血等)也會隨之升高，導(dǎo)致患者對第二眼手術(shù)的滿意度下降。

當(dāng)前，臨床上對于第一眼和第二眼白內(nèi)障手術(shù)眼部疼痛感知差異的研究相對較少，有關(guān)第二眼白內(nèi)障手術(shù)痛覺敏感性增強(qiáng)(痛覺過敏)的研究主要限于臨床觀察水平，缺乏對相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究。本研究通過檢測兔第一眼晶狀體超聲乳化吸出術(shù)后不同時(shí)期，非手術(shù)眼房水及血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)及該眼角膜知覺敏感度，并與術(shù)前基線值相比，探討非手術(shù)眼房水及血清中TNF-α及IL-1β的變化與該眼角膜知覺敏感度變化之間的關(guān)系，進(jìn)而探討第一眼晶狀體超聲乳化吸出術(shù)后，第二眼痛覺過敏的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料選取健康成年新西蘭大白兔40只作為實(shí)驗(yàn)對象，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，實(shí)驗(yàn)前雙眼經(jīng)裂隙燈和眼底檢查均正常。常規(guī)飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大白兔分為實(shí)驗(yàn)組與空白對照組，實(shí)驗(yàn)組25只，空白對照組15只。實(shí)驗(yàn)組手術(shù)眼與空白對照組第一眼采用隨機(jī)數(shù)字編號入組，實(shí)驗(yàn)組一眼行晶狀體超聲乳化吸出術(shù)，根據(jù)術(shù)后取材時(shí)間分為術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d共5組，每組5只動物?？瞻讓φ战M按照對應(yīng)取材時(shí)間也分為5組，每組3只動物。實(shí)驗(yàn)動物的使用均遵循實(shí)驗(yàn)動物醫(yī)學(xué)倫理?xiàng)l例及國家實(shí)驗(yàn)動物管理保護(hù)條例。

1.2 主要試劑及儀器兔TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(中國Bio-Swamp公司)，血液樣品總RNA小計(jì)量提取試劑盒(中國Magen公司)，手術(shù)顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)，超聲乳化儀(美國Alcon公司)。

1.3 方法

1.3.1 手術(shù)方法術(shù)前3 d每只兔雙眼滴5 g·L-1左氧氟沙星(日本參天制藥有限公司)，每天4次，超聲乳化吸出術(shù)由同一經(jīng)驗(yàn)豐富的術(shù)者完成。術(shù)前30 min用復(fù)方托吡卡胺(沈陽興齊制藥有限公司)散瞳3 次，術(shù)前10 min用表面麻醉劑丙美卡因(南京瑞年百思特制藥有限公司)滴眼2次，速眠新Ⅱ注射液(敦化市圣達(dá)動物藥品有限公司)肌肉注射麻醉(0.3 mL·kg-1)，常規(guī)消毒手術(shù)野。鋪無菌洞巾，開瞼器開瞼，聚維酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)滴眼，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊。

超聲乳化吸出術(shù)：實(shí)驗(yàn)組術(shù)眼于房水抽取后自穿刺口向前房注入平衡鹽溶液，恢復(fù)前房深度。在上方2.2 mm處行透明角膜切口，前房注入黏彈劑，環(huán)形撕囊直徑5 mm，水分離，超聲乳化吸出軟核，注吸皮質(zhì)，角膜切口水密。手術(shù)結(jié)束后，術(shù)眼涂妥布霉素地塞米松眼膏(美國Alcon公司)，清醒后放入兔房正常喂養(yǎng)。術(shù)后用藥：術(shù)后1周內(nèi)，術(shù)眼滴妥布霉素地塞米松滴眼液，每天4次，此后逐周遞減1次，4周后停用。

1.3.2 觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動物雙眼的結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)情況于術(shù)前及術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，在裂隙燈下分別觀察并記錄兩組實(shí)驗(yàn)動物雙眼的結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)情況，兔眼結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 兔眼結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 各組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平檢測采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平。于術(shù)前及術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，分別取實(shí)驗(yàn)組與空白對照組兔肢體血液5 mL，離心后取血清，按照試劑盒說明書提取血清總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測RNA的純度及濃度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄后，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用GAPDH作為內(nèi)參照。實(shí)時(shí)定量PCR所使用引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,其中TNF-α引物序列：上游為5’-ATGAGCACTGAAAGCATGA-3’，下游為5’- GAGGGCTGATTAGAG-3’；IL-1β引物序列:上游為5’-GTCTTCCTAAAGCAAGCC-3’，下游為 5’- GGGGTGTCACAATCTGT-3’；GAPDH引物序列:上游為 5’- GATGCTGGTGCCGAGTAC-3’，下游為5’- GCTGAGATGATGACCCTTTT-3’。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸 2 min,總共 35 個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法定量目的基因TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平。

1.3.4 兔房水TNF-α、IL-1β蛋白濃度檢測術(shù)前由同一實(shí)驗(yàn)者取實(shí)驗(yàn)組動物術(shù)眼及空白對照組動物第一眼房水。術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，取實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼及空白對照組第二眼房水。取房水前用聚維酮碘消毒，丙美卡因滴眼液表面麻醉，用30 G針頭滅菌注射器，自顳上角膜緣內(nèi)0.5 mm穿刺進(jìn)入前房抽取房水0.1 ～0.2 mL。用ELISA法檢測房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度。依序測量450 nm波長處光密度(D)值，以TNF-α和IL-1β濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出房水中TNF-α和IL-1β蛋白相應(yīng)濃度。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.5 角膜知覺敏感度檢測于術(shù)前及術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，由同一實(shí)驗(yàn)者使用Cochet-Bonnet 角膜知覺計(jì)(法國Luneau Ophthalmologie公司)測量實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼與空白對照組第二眼角膜知覺。角膜知覺計(jì)的尼龍纖維長度為0～60 mm，可調(diào)節(jié)，直徑為 0.12 mm。尼龍纖維長度與其施加于角膜的壓力呈負(fù)相關(guān)，即長度越長，對角膜的壓力越小。測量前，將兔置于安靜室內(nèi)環(huán)境，受檢兔清醒，精神狀態(tài)良好。測量從60 mm開始，測量時(shí)將角膜知覺計(jì)的尼龍絲垂直于兔角膜中央表面，輕施壓力，每次遞減5 mm，直至出現(xiàn)被檢測眼眨眼及躲避行為作為兔眼角膜知覺陽性反應(yīng)，同一長度測量3次，每次測量間隔30 min，如果3次檢測中出現(xiàn)2次陽性反應(yīng)視為陽性結(jié)果，引起該陽性結(jié)果的尼龍纖維長度即為角膜知覺敏感度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用單因素重復(fù)測量ANOVA及兩兩比較兩組內(nèi)各取材時(shí)間點(diǎn)房水、血清中細(xì)胞因子及角膜知覺敏感度差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后眼前節(jié)炎癥反應(yīng)情況實(shí)驗(yàn)組25眼手術(shù)眼的結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)級別，在術(shù)后1 d均為Ⅱ級，術(shù)后3 d、7 d為Ι～Ⅱ級，術(shù)后14 d降至Ι級，術(shù)后21 d恢復(fù)至0級。實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼與空白對照組雙眼在不同時(shí)間點(diǎn)，結(jié)膜充血、角膜混濁及前房炎癥反應(yīng)級別均為0級。

2.2 兩組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平的變化以兩組兔術(shù)前血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平為基線值。實(shí)驗(yàn)組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平在手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=272.800、193.530，均為P<0.05)。術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，實(shí)驗(yàn)組兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平均較基線值升高，術(shù)后7 d達(dá)高峰(TNF-α mRNA相對表達(dá)量為14.95±0.89，IL-1β mRNA相對表達(dá)量為7.56±0.46)，之后逐漸下降，術(shù)后21 d降至術(shù)前水平。實(shí)驗(yàn)組各相鄰取材時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。空白對照組各取材時(shí)間點(diǎn)，兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)與基線值相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.612、0.626，均為P>0.05)(見圖1)。

圖1 術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)兩組兔血清TNF-α mRNA及IL-1β mRNA表達(dá)水平的變化 相同時(shí)間點(diǎn)兩組相比,*P<0.05

2.3 兩組兔房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度變化以實(shí)驗(yàn)組術(shù)前手術(shù)眼、空白對照組第一眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度為基線值。實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度在不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=184.200、82.900，均為P<0.05)。術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，非手術(shù)眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度均較基線值升高，其中峰值出現(xiàn)于術(shù)后7 d[TNF-α蛋白濃度為(162.34±5.71) ng·L-1，IL-1β蛋白濃度為(16.68±0.74)ng·L-1]，之后逐漸下降，術(shù)后21 d降至術(shù)前水平。實(shí)驗(yàn)組相鄰取材時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，非手術(shù)眼房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M第二眼不同取材時(shí)間點(diǎn)房水TNF-α和IL-1β蛋白濃度與基線值相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.140、0.820，均為P>0.05)(見圖2)。

2.4 角膜知覺敏感度變化以實(shí)驗(yàn)組術(shù)前非手術(shù)眼及空白對照組第二眼角膜知覺敏感度為基線值。實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼角膜知覺敏感度在不同時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=244.910，P<0.05)；術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，非手術(shù)眼角膜知覺敏感度較基線值升高，于術(shù)后7 d角膜知覺敏感度最高，之后角膜知覺敏感度逐漸下降，術(shù)后21 d基本恢復(fù)至基線水平。實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼相鄰時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，角膜知覺敏感度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)?？瞻讓φ战M第二眼不同時(shí)間點(diǎn)角膜知覺敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.344，P>0.05)(見表2)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組非手術(shù)眼與空白對照組第二眼不同時(shí)間點(diǎn)房水TNF-α及IL-1β濃度的變化 相同時(shí)間點(diǎn)兩組相比,*P<0.05

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)角膜知覺敏感度變化

3 討論

白內(nèi)障超聲乳化吸出術(shù)是目前治療白內(nèi)障的最有效方法[4]。隨著小切口、微切口手術(shù)技術(shù)的提高及人工晶狀體設(shè)計(jì)方案的不斷完善,白內(nèi)障超聲乳化吸出術(shù)后患者視覺質(zhì)量已得到極大提升[5]。然而，關(guān)于第一眼白內(nèi)障術(shù)后，第二眼痛覺敏感性增強(qiáng)(痛覺過敏)這一常見問題并未受到臨床廣泛重視。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，雙眼白內(nèi)障患者對首次和第二次白內(nèi)障手術(shù)的主觀感覺評估存在差異，第一眼白內(nèi)障手術(shù)后，對側(cè)眼可能存在交感性葡萄膜炎，導(dǎo)致第二眼手術(shù)更加疼痛。另有文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，如果患者在第一眼手術(shù)過程中存在對光敏感、術(shù)前精神壓力大及術(shù)后畏光等癥狀，會導(dǎo)致心理負(fù)擔(dān)加重，進(jìn)而影響他們第二眼術(shù)中對疼痛的感知。

國際疼痛研究學(xué)會神經(jīng)病理性疼痛特別興趣小組將神經(jīng)病理性疼痛界定為由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病所導(dǎo)致的疼痛[10]。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β除可以誘導(dǎo)白細(xì)胞活化、趨化、誘發(fā)炎癥反應(yīng)外[11]，在神經(jīng)系統(tǒng)中還可以作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)增強(qiáng)感覺神經(jīng)元敏感性，導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛(包括痛覺過敏)[12]。正常情況下,TNF-α、IL-1β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)很低，神經(jīng)受損傷后，該細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，并在神經(jīng)系統(tǒng)中呈雙向轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，細(xì)胞因子逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞，參與中樞部位細(xì)胞因子的激活，這是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制之一[14]。

Zong等[15]對大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄模型(chronic constriction injury model，CCI)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓中，TNF-α mRNA在術(shù)后表達(dá)升高，術(shù)后7 d達(dá)到高峰，術(shù)后14 d已經(jīng)開始下降，術(shù)后21 d恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。此外，CCI大鼠機(jī)械縮足反射閾值降低，以術(shù)后7 d時(shí)最低，之后緩慢回升，術(shù)后21 d仍未升至術(shù)前水平。Okamoto等[16]測定CCI大鼠坐骨神經(jīng)中TNF-α mRNA發(fā)現(xiàn)，術(shù)后14 d TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高，IL-1β mRNA 于術(shù)后7 d表達(dá)上調(diào)，證實(shí)其可能參與傷害性信息的傳遞過程，致敏中樞神經(jīng)元。Laughlin等[17]研究經(jīng)腹腔內(nèi)注射強(qiáng)啡肽誘發(fā)的痛覺過敏大鼠模型發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)應(yīng)用IL-1β拮抗劑可有效阻止痛覺過敏反應(yīng)的發(fā)生。以上研究結(jié)果均證實(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，TNF-α、IL-1β可以作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)增強(qiáng)感覺神經(jīng)元敏感性，導(dǎo)致痛覺過敏。

Fiore等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)眼睛受到創(chuàng)傷(包括術(shù)源性創(chuàng)傷)如白內(nèi)障摘出術(shù)后，創(chuàng)傷眼房水中炎癥因子(包括TNF-α、IL-1β)的含量顯著增加。TNF-α是將特定炎癥與炎癥反應(yīng)聯(lián)系起來的關(guān)鍵因素[19]，可通過刺激巨噬細(xì)胞增加IL-1β分泌。 TNF-α的作用表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性，其含量可以反映炎癥的嚴(yán)重程度。IL-1β生物學(xué)效應(yīng)與TNF-α相似，可引起炎癥并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[20]，誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)，刺激免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，形成惡性循環(huán)并加速炎癥反應(yīng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在第一眼術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，TNF-α、 IL-1β在非手術(shù)眼房水及血清中表達(dá)均上調(diào)，說明手術(shù)創(chuàng)傷不僅直接導(dǎo)致術(shù)眼的眼內(nèi)炎癥反應(yīng)，同時(shí)，還可導(dǎo)致非創(chuàng)傷眼房水及血清中炎癥因子表達(dá)上調(diào)。

支配眼部感覺的神經(jīng)是三叉神經(jīng)眼支。角膜是三叉神經(jīng)眼支末梢神經(jīng)分布最為密集的部位，對外界傷害性刺激的敏感性最高。由于在動物實(shí)驗(yàn)中，痛覺這一主觀感受到目前為止仍無法通過動物表述等方法來直接評價(jià)，因此，本研究參考大鼠CCI原理，即通過機(jī)械刺激觀察大鼠縮足反射來評價(jià)其疼痛閾值改變，采用角膜知覺計(jì)檢測成年兔角膜接受機(jī)械刺激后出現(xiàn)眨眼及躲避等行為學(xué)表現(xiàn)，獲得角膜知覺敏感度，分析其變化規(guī)律，進(jìn)而間接評價(jià)眼部痛覺敏感度變化。本研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行第一眼手術(shù)后1～14 d內(nèi)，兔非手術(shù)眼房水中與痛覺過敏相關(guān)的TNF-α與IL-1β表達(dá)都有明顯升高，尤其在術(shù)后7 d達(dá)到峰值，并且同一炎癥因子在血清與房水中的變化趨勢呈平行關(guān)系。同時(shí)，非手術(shù)眼在第一眼術(shù)后14 d內(nèi)，其角膜知覺敏感度也較手術(shù)前增高，這一變化與TNF-α、IL-1β表達(dá)上調(diào)存在時(shí)程相關(guān)性。本研究結(jié)果提示我們，導(dǎo)致非手術(shù)眼角膜知覺敏感度提高的原因，可能與第一眼手術(shù)創(chuàng)傷引起血清及對側(cè)眼房水TNF-α與IL-1β表達(dá)上調(diào)，繼而造成該眼三叉神經(jīng)感覺支敏感化有關(guān)，而三叉神經(jīng)感覺支敏感化則可進(jìn)一步導(dǎo)致眼部痛覺過敏。因此，本研究推測患者在第一眼白內(nèi)障術(shù)后，第二眼痛覺敏感性增強(qiáng)，并不只是一個(gè)簡單的精神心理反應(yīng)，其中的病理生理學(xué)機(jī)制可能更為復(fù)雜。

本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)兔在第一眼術(shù)后2周內(nèi)，其非手術(shù)眼角膜知覺敏感度提高，這對在臨床中選擇更合適的第二眼手術(shù)時(shí)機(jī)有一定參考意義。然而，有關(guān)血清及房水TNF-α與IL-1β表達(dá)上調(diào)與角膜知覺敏感度變化間的調(diào)控通路，及角膜知覺敏感度變化與痛覺過敏之間的內(nèi)在聯(lián)系，還需進(jìn)一步深入研究加以驗(yàn)證。