鄭燕燕 黃德華 李金龍 張會(huì)飛 鮑印廣 倪 飛 吳佳潔

小麥高效轉(zhuǎn)基因受體品系CB037的抗條銹性分析

鄭燕燕 黃德華 李金龍 張會(huì)飛 鮑印廣 倪 飛 吳佳潔*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東泰安 271018

小麥遺傳轉(zhuǎn)化是開展小麥基因克隆、基因編輯及基因工程等研究的重要基礎(chǔ)。獲得易于轉(zhuǎn)化及遺傳背景純合的受體材料是高效開展小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。近年來, 小麥品系CB037作為受體材料被廣泛利用, 并獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率, 在小麥研究中發(fā)揮了重要作用。雖然野生型CB037農(nóng)藝性狀整齊一致, 但遺傳背景并不純合, 對小麥條銹菌(f. sp.)表現(xiàn)高感和高抗兩種不同反應(yīng)。本研究分離了抗病株系CB037-PstR及感病株系CB037-PstS, 并創(chuàng)建了F2分離群體。遺傳分析表明, CB037-PstR攜帶單個(gè)顯性抗病基因。利用BSR-Seq測序分析及分子標(biāo)記檢測, 將抗病位點(diǎn)定位于1B染色體短臂。進(jìn)一步熒光原位雜交表明, CB037-PstR為1BL/1RS易位系, 可能攜帶抗條銹病基因。本研究明確了CB037的遺傳背景及其抗條銹性, 并分離了抗病及感病株系, 為有效利用CB037作為受體材料開展小麥轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

小麥遺傳轉(zhuǎn)化; 1BL/1RS易位系; 條銹病抗性; BSR-Seq;

小麥遺傳轉(zhuǎn)化是開展功能基因組學(xué)研究的重要方法, 可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因或功能元件的表達(dá)調(diào)控及序列編輯, 也是實(shí)現(xiàn)基因工程改良的重要手段[1]。不同植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率相差很大, 其中小麥屬于較難轉(zhuǎn)化的作物之一[2], 其基因工程育種進(jìn)程遠(yuǎn)落后于水稻、玉米、大豆等農(nóng)作物[3]。近年來, 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷優(yōu)化, 小麥轉(zhuǎn)化效率取得了大幅度提高[4-6]。日本煙草公司的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Purewheat)可實(shí)現(xiàn)40%~90%的轉(zhuǎn)化效率[7]。植物遺傳轉(zhuǎn)化效率也依賴受體基因型, 我國現(xiàn)已篩選出多個(gè)易于轉(zhuǎn)化的小麥材料, 如小麥品系CB037及主推品種科農(nóng)199、周麥18、內(nèi)麥836等[8-9]。在不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡霓D(zhuǎn)基因研究中, 選擇恰當(dāng)?shù)氖荏w材料至關(guān)重要。深入了解受體品種的基因型及農(nóng)藝性狀, 對于有效開展小麥轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義。

CB037是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所培育的高代品系: 農(nóng)藝性狀優(yōu)良、對白粉病免疫、生長周期短[10-11], 而且具有良好的組織培養(yǎng)能力及再生性能。張偉等[8]對24個(gè)優(yōu)良小麥品種及CB037進(jìn)行花藥培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng), 結(jié)果顯示CB037的組織培養(yǎng)再生效率最高, 其中幼胚組織培養(yǎng)再生能力可達(dá)120%。董魯浩等[12]利用添加TDZ (thidiazuron, 0.5 mg L–1)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)CB037成熟胚,可獲得大于90%的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和近50%的愈傷組織分化率。CB037作為理想的受體材料, 已頻繁地應(yīng)用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化[9,13-14]。

小麥條銹病是全球范圍內(nèi)影響小麥生產(chǎn)的嚴(yán)重病害, 其致病菌條形柄銹菌小麥?；?f. sp., Pst)為活體營養(yǎng)專性寄生真菌, 存在有性生殖、毒性變異快, 可導(dǎo)致抗病基因在生產(chǎn)上使用3~5年后便喪失抗性[15]?？寺⌒碌目箺l銹病基因以及開展小麥-銹菌互作機(jī)制研究, 對于培育抗條銹病小麥品種具有重要意義。為有效開展抗條銹病基因的功能驗(yàn)證[13]、感銹病基因的敲除[16]以及針對條銹菌的寄主誘導(dǎo)基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)等研究[17], 獲得高感條銹病且易轉(zhuǎn)化的受體小麥?zhǔn)且豁?xiàng)重要條件。小麥品系CB037常作為感條銹病材料用于轉(zhuǎn)基因研究, 但是我們注意到非轉(zhuǎn)基因受體中常存在部分個(gè)體表現(xiàn)抗病, 對轉(zhuǎn)基因后代的表型分析帶來障礙。本研究通過表型鑒定分離了抗病及感病CB037株系, 并通過轉(zhuǎn)錄組測序及遺傳分析對抗病位點(diǎn)進(jìn)行了染色體定位, 為種質(zhì)材料CB037的有效利用提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春性小麥材料CB037由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所陳孝研究員選育, 葉興國研究員饋贈(zèng)。材料在山東泰安山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田及室內(nèi)種植。小麥條銹菌采用山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田繁殖的混合孢子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥條銹菌接種鑒定 苗期鑒定采用涂抹法。將新鮮條銹菌孢子與滑石粉按1∶10比例混合, 用小毛刷輕輕涂抹于一葉一心期小麥葉片。接菌后將植株置于10℃暗培養(yǎng)24 h, 保持相對濕度100%; 然后置于16 h光照/15℃、8 h黑暗/10℃條件下生長。2~3周后記錄表型。田間材料接種采用孢子懸浮液注射法。于每年3月中旬小麥起身期, 使用注射器(針頭0.6 mm × 25.0 mm)向小麥莖稈注射孢子懸浮液, 至心葉中有孢子水溢出。接種后田間澆水增加濕度。隔周重復(fù)接菌1~2次。以小麥品種輝縣紅作為感病對照, 4~6周后調(diào)查表型。表型鑒定標(biāo)準(zhǔn)采用國際常用九級抗病表型分類方法[18]。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析 CB037-PstR、CB037-PstS及F2感病單株取苗期葉片, 使用TRIzol法提取總RNA。由北京貝瑞和康公司進(jìn)行樣品質(zhì)檢及建庫測序, 測序平臺(tái)為Illumina NovaSeq 6000, 測序讀長為PE 150 bp, 每個(gè)樣本不少于10 Gb測序量。測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后, 利用STAR v2.7 (https:// github.com/alexdobin/STAR)進(jìn)行mapping, 參考基因組為IWGSC RefSeq v1.0 (https://www.wheatgenome. org/), 并利用GATK v3.8 (https://gatk.broadinsti tute.org/)進(jìn)行SNPs和InDels的挖掘。

1.2.3 分子標(biāo)記開發(fā) 選擇多態(tài)性位點(diǎn)兩翼序列共400 bp, 比對小麥基因組(http://202.194.139.32/)并分析A/B/D基因組間差異, 設(shè)計(jì)基因組特異PCR引物, 根據(jù)酶切位點(diǎn)或InDel長度開發(fā)CAPS或InDel標(biāo)記。另外, 還利用了基因已報(bào)道的分子標(biāo)記,[19]、[20]和[21]。

1.2.4 分子標(biāo)記PCR檢測 PCR擴(kuò)增總體系20 μL: 含1.0 μL模板DNA (100 ng μL–1)、10 μL 2×GreenMix (諾唯贊生物科技有限公司)、正向和反向引物(10 μmol L–1)各0.5 μL、ddH2O 8 μL。PCR儀使用GeneAmp 9700 (Life Technologies)。擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 55~58℃退火30 s, 溫度根據(jù)分子標(biāo)記設(shè)定, 72℃延伸30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min, 15℃保存。酶切體系(CAPS標(biāo)記): PCR產(chǎn)物15 μL、ddH2O 1.8 μL、內(nèi)切酶 0.3 μL、緩沖液1.9 μL; 酶切3 h。

1.2.5 原位雜交 染色體制片參照Han等[22]方法。基因組原位雜交(GISH)以黑麥基因組DNA為探針、中國春DNA為封阻。熒光原位雜交(FISH)參照Huang等[23]方法, 以TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine)標(biāo)記的pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3、AFA-4和FAM (6-carboxyfluorescein)標(biāo)記的pSc119.2-1、(GAA)10為探針。鏡檢使用Nikon (ECLIPSE Ni-U型)熒光顯微鏡, 用DS-Ril型CCD機(jī)(Nikon)進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品系CB037抗小麥條銹病表型鑒定

在小麥品系CB037不同單株混收的種子中, 隨機(jī)選擇部分籽粒進(jìn)行種植, 并在苗期接種條銹菌, 2~3周后進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果表明, 品系CB037對小麥條銹菌的抗性存在分離。其中多數(shù)個(gè)體高感條銹病, 接種部位出現(xiàn)大量孢子堆, 反應(yīng)型ITs=7~8; 少數(shù)個(gè)體表現(xiàn)條銹病抗性, 接種部位出現(xiàn)明顯褪綠及壞死斑, 無孢子堆痕跡, 反應(yīng)型ITs = 2~3 (圖1)。在田間種植材料中, CB037株行在成株期高感小麥條銹病; 但同時(shí)可觀察到少量抗病單株(圖1)。隨機(jī)選擇2個(gè)感病單株、5個(gè)抗病單株抽穗后進(jìn)行套袋自交, 并進(jìn)一步對其自交后代(各100粒)進(jìn)行接種鑒定。結(jié)果表明, 兩類株系的感病、抗病表型均穩(wěn)定遺傳, 株系內(nèi)未出現(xiàn)分離。對鑒定獲得的感條銹病、抗條銹病株系分別命名為CB037-PstS和CB037-PstR。

圖1 CB037所分離出的兩個(gè)株系對條銹菌的不同反應(yīng)

1, 2: 苗期葉片; 3: 成株期葉片。

1, 2: seedlings leaf; 3: adult plant leaf.

2.2 抗小麥條銹病株系CB037-PstR的遺傳分析

以感病株系CB037-PstS為父本、抗病株系CB037-PstR為母本, 創(chuàng)建F2分離群體。81個(gè)F2單株獲得了苗期條銹菌接種鑒定表型。其中, 63株表現(xiàn)抗病(ITs=1~3), 18株表現(xiàn)感病(ITs=5~8), 抗、感呈現(xiàn)3﹕1分離比例, 符合單個(gè)顯性抗病基因遺傳(χ2= 0.33,= 1,= 0.5)。

為確定該抗病位點(diǎn)的染色體定位, 本研究首先開展了轉(zhuǎn)錄組測序。測序樣品包括由13個(gè)感病F2單株構(gòu)成的混合池, 及親本CB037-PstR、CB037- PstS。利用NovaSeq 6000平臺(tái), 分別獲得了36.0、74.7、60.5百萬條paired-end reads。以中國春序列作為參考基因組, 比較抗病材料(CB037-PstR)、感病材料(CB037-PstS及F2混合池)之間的多態(tài)性位點(diǎn), 結(jié)果共篩選到3767個(gè)純合的SNP或InDel位點(diǎn)。其中2770 (73.5%)個(gè)位點(diǎn)分布于1B染色體, 尤其富集在1B染色體短臂及著絲粒附近(圖2)。多態(tài)性位點(diǎn)較為富集的染色體包括2B (371, 9.8%)、3B (253, 6.7%)和1D (104, 2.8%); 而9條染色體(3D、4D、5A、5D、6A、6B、6D、7A、7B)上未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)(圖2)。

圖2 抗病株系CB037-PstR與感病株系CB037-PstS及F2感病單株混合池間差異位點(diǎn)的染色體分布圖

豎線及綠色圓點(diǎn)分別代表小麥染色體及著絲粒。上方數(shù)字及字母代表染色體編號, 下方數(shù)字為定位于該染色體的SNP及InDel數(shù)量, 短橫線代表SNP及InDel所在位置。左側(cè)標(biāo)尺代表染色體長度, 單位Mb。

Vertical lines and green dots represent wheat chromosomes and centromeres, respectively. Numbers and letters on top identify each chromosome. Numbers below each chromosome mark the amount of the SNPs and InDels mapped on each chromosome. Short horizontal lines indicate positions of SNPs or InDels.

利用多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)了5個(gè)分子標(biāo)記以區(qū)分CB037-PstS和CB037-PstR基因型, 其中4個(gè)位于1B染色體, 1個(gè)位于4A染色體(表1)。對81個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)CB037-PstR攜帶的抗條銹病位點(diǎn)與1B染色體的4個(gè)標(biāo)記連鎖, 與4A染色體上的標(biāo)記無連鎖關(guān)系。其中, 位于1B染色體短臂的3個(gè)標(biāo)記(、、)與抗條銹病表型完全連鎖; 1B染色體長臂的標(biāo)記與抗條銹病位點(diǎn)有重組, 遺傳距離3.7 cM。

為明確小麥品系CB037的遺傳組成, 對實(shí)驗(yàn)室保存的CB037混收種子隨機(jī)選取100粒, 利用和鑒定幼苗基因型, 發(fā)現(xiàn)80粒符合感病株系CB037-PstS的基因型, 20粒符合抗病株系CB037-PstR基因型。該結(jié)果與CB037混收籽粒的表型鑒定結(jié)果相一致, 多數(shù)個(gè)體對條銹菌感病, 少數(shù)個(gè)體表現(xiàn)抗病。

aCAPS分子標(biāo)記;bInDel分子標(biāo)記; CBS和CBR分別代表CB037-PstS、CB037-PstR。

aCAPS marker;bInDel marker; CBS and CBR represent CB037-PstS and CB037-PstR, respectively.

2.3 抗小麥條銹病株系CB037-PstR的染色體分析

鑒于CB037-PstR攜帶的抗病位點(diǎn)定位于1BS染色體臂, 我們在抗、感2個(gè)株系及其F2群體中對抗條銹病基因進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測。結(jié)果表明, 3個(gè)標(biāo)記、、均與抗病性狀共分離(圖3), 表明CB037-pstR攜帶黑麥的1RS染色體易位。

以CB037-PstS、CB037-PstR為材料, 進(jìn)一步開展了FISH及GISH雜交鑒定。以黑麥的總基因組DNA作探針、以中國春的DNA作封阻。如圖4所示, CB037-PstR中可見一對染色體的短臂上具有明顯的綠色雜交信號(圖4-C), 而CB037-PstS未見任何雜交信號(圖4-A)。根據(jù)GISH結(jié)果對染色體進(jìn)行識別, 可見發(fā)生易位的染色體為1B染色體長臂(圖4-B, D)。該結(jié)果表明, CB037-PstR株系為1BL/1RS易位系材料, 而CB037-PstS不攜帶1RS。

圖3 抗條銹病基因Yr9分子標(biāo)記(iag95, AF1/4, H20)的檢測結(jié)果

S、R分別表示F2個(gè)體的感病及抗病表型; CK為空白對照。

Letters S and R indicate phenotypes of susceptible and resistant of F2individuals; CK is the blank control.

圖4 CB037兩個(gè)株系的染色體熒光原位雜交鑒定

A, B: CB037-PstS; C, D: CB037-PstR; A和C: GISH鑒定; B和D: FISH鑒定。標(biāo)尺長度為10 μm。

A, B: CB037-PstS; C, D: CB037-PstR; A & C: GISH patterns; B & D: FISH patterns. Bar = 10 μm.

3 討論

小麥品系CB037具有良好的組織培養(yǎng)再生能力及優(yōu)良的農(nóng)藝性狀, 在小麥轉(zhuǎn)基因研究中被廣泛利用。本研究通過苗期、成株期的條銹菌接種鑒定, 及世代間材料的重復(fù)鑒定, 發(fā)現(xiàn)CB037為混合群體, 包含分別表現(xiàn)抗病或感病的不同個(gè)體。其后代株系的表型穩(wěn)定遺傳, 未出現(xiàn)分離。分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明, 混收籽粒中抗病和感病基因型分別占20%和80%, 該比例與表型鑒定結(jié)果相一致。雖然CB037品系個(gè)體間的抗條銹性存在差異, 但是株高、穗型等農(nóng)藝性狀未見明顯差別。在CB037-PstS、CB037-PstR的轉(zhuǎn)錄組測序中, 以中國春序列作為參考共鑒定到70,021個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 其中二者相同的位點(diǎn)有63,837個(gè), 占91.2%。如果扣除抗病材料在1B染色體上特異的多態(tài)性位點(diǎn)(2770個(gè)), CB037- PstS與CB037-PstR的相似性為94.9%。該結(jié)果表明, CB037品系中的抗條銹病個(gè)體并非來自小比例的種子污染或花粉污染, 而是來自育種剩余變異[24]。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CB037-PstR的條銹病抗性受單基因控制, 并通過BSR-seq (bulked segregant RNA-sequencing)分析, 將其定位于1B染色體短臂。對1BS染色體的2個(gè)已知基因和進(jìn)行了檢測, 發(fā)現(xiàn)二者均不存在于CB037-PstR(未發(fā)表數(shù)據(jù)); 而黑麥1RS染色體上的分子標(biāo)記與CB037-PstR的抗銹性完全連鎖。細(xì)胞學(xué)證據(jù)進(jìn)一步表明CB037-pstR為1BL/1RS易位系, 因此可能攜帶基因。雖然對我國條銹病主要流行小種已喪失抗性, 但本研究中利用的混合孢子對CB037-PstR沒有毒性, 而且對典型的攜帶基因的小麥品種魯麥15也沒有毒性(未發(fā)表數(shù)據(jù))。該混合孢子的菌系組成還有待明確。另外, 雖然早已被克服, 但在我國仍被廣泛利用, 而且小麥育種中不斷引入了新型的1B/1R易位系[15,25]。因此, 不能排除CB037-PstR可能攜帶等位基因或其它抗病基因。

本研究自小麥品系CB037分離了抗銹性不同的2個(gè)株系, 為有效利用CB037作為受體材料開展小麥轉(zhuǎn)基因研究提供了重要參考。CB037-PstS 高感小麥條銹病, 可便于開展小麥-條銹菌互作相關(guān)基因的功能研究?？共≈晗礐B037-PstR不但具有簇毛麥來源的抗白粉病基因[10], 還可能具有黑麥來源的抗條銹病基因及抗葉銹病基因、抗稈銹病基因、抗白粉病基因[19]。雖然對我國主要條銹病流行小種已喪失抗性, 但是與、等基因聚合仍然可以增強(qiáng)品種抗病性[15]。因此, CB037-PstR可以作為優(yōu)良的抗病種質(zhì)材料開展基因工程育種。1BL/1RS易位系品種雖然具有良好的抗病性、抗逆性和豐產(chǎn)性, 但是在品質(zhì)性狀上卻存在明顯不足[26]。位點(diǎn)位于1RS遠(yuǎn)著絲粒端, 編碼多拷貝ω-黑麥堿基因; 通過遺傳工程降低或去除ω-黑麥堿基因表達(dá)量, 是解決1BL/1RS 易位系小麥面團(tuán)加工品質(zhì)差的重要途徑[27-28]。CB037-PstR作為易于轉(zhuǎn)化的1BL/1RS易位系材料, 在ω-黑麥堿基因的基因工程研究中將具有顯著優(yōu)勢。

轉(zhuǎn)基因研究中, 不同受體的遺傳轉(zhuǎn)化效率相差很大, 基因型是主要影響因素。體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶等多類基因都可能影響植物組織培養(yǎng)再生效率[29]。實(shí)踐表明, 借助某些關(guān)鍵基因的表達(dá)可顯著提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率(發(fā)明專利201710422896.6)。定位及分離影響小麥組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因, 對于提高基因工程研究水平具有重要意義, 也是目前的研究熱點(diǎn)之一[29]。CB037-PstS和CB037-PstR除了抗銹性具有明顯差別外, 轉(zhuǎn)化效率也存在較大差異(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。鑒于二者具有很高的遺傳相似性, 可作為近等基因系開展小麥組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因的遺傳分析及定位研究。

4 結(jié)論

小麥品系CB037為混系材料, 包含對小麥條銹菌表現(xiàn)高感及高抗的個(gè)體, 并以高感個(gè)體為主?？共≈晗礐B037-PstR為1BL/1RS易位系, 其抗病位點(diǎn)受單基因控制, 定位于1B染色體短臂。

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Analysis of the stripe rust resistance in a wheat line CB037 with high regeneration and transformation efficiency

ZHENG Yan-Yan, HUANG De-Hua, LI Ji-Long, ZHANG Hui-Fei, BAO Yin-Guang, NI Fei, and WU Jia-Jie*

State Key Laboratory of Crop Biology / College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong, China

Genetic transformation is used for efficient gene cloning, gene editing and gene engineering, etc. Obtaining recipient lines amenable to transformation and with pure genetic background is critical for high efficiency transformations. For recent years, the wheat inbreed line CB037 had been widely used as a recipient for transgenes and obtain its high transformation potential. Despite having stable agronomic traits, the CB037 is genetically heterogeneous for resistance to wheat stripe rust (f. sp., Pst). In this study, the-resistant line CB037-PstR and-susceptible line CB037-PstS were isolated, and their F2population was created. Genetic analysis showed that the CB037-PstR carried a single dominant resistance gene. The identified resistance gene was mapped on the short arm of chromosome 1B using BSR-seq and molecular marker analysis. GISH results further revealed that CB037-PstR is a 1BL/1RS translocation line and likely carried. This study segregated genetic heterogeneity in CB037 for stripe rust resistance and isolated its-susceptible and resistant lines. These results will facilitate trait-oriented use of CB037 in genetic engineering of wheat.

wheat transformation; 1BL/1RS translocation line; stripe rust resistance; BSR-Seq;

10.3724/SP.J.1006.2020.01016

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08009003001)和山東省高等學(xué)?！扒鄤?chuàng)科技計(jì)劃”項(xiàng)目(2019KJF026)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08009003001) and the Youth Innovation and Scientific Program of Higher Education of Shandong (2019KJF026).

吳佳潔, E-mail: jiajiewu@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8242213

E-mail:zyy18854889722@163.com, Tel: 0538-8242279

2020-02-24;

2020-06-02;

2020-06-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200615.1520.004.html