黃馨瑤，王雪雯，柳云恩，李雪玉

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1.急診醫(yī)學(xué)科 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.護(hù)理部，遼寧 沈陽 110016

爆震傷極易導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷[1]，常誘發(fā)肢體感覺運(yùn)動障礙，損傷學(xué)習(xí)及認(rèn)知等能力的損傷[2]。創(chuàng)傷性腦損傷(blast-induced traumatic brain injury，bTBI)的病理生理過程有其特有性質(zhì)，目前，對于bTBI的救治方案主要根據(jù)臨床腦損傷的常規(guī)救治方法進(jìn)行診療，而早期篩選和評估的相關(guān)研究較少。本課題采用實(shí)驗(yàn)室爆震傷仿真裝置，通過建立爆震傷模型，分析小鼠腦組織中病理結(jié)果變化，研究顱腦損傷的早期病理生理，探尋識別早期顱腦爆震傷可靠指標(biāo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取20只健康的SPF級(c57BL/6)小鼠(雄性，體質(zhì)量約18～22 g)，由醫(yī)院的創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室提供，動物自由飲食、飲水。壓力感應(yīng)器購自美國GE公司；食用白色素購自Palmer Paint Products公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將20只小鼠平均分為正常對照組和bTBI模型組，每組各10只。

1.2.2 爆震傷模擬裝置的設(shè)計(jì) 內(nèi)部裝有的空氣壓縮器主要連接空氣壓力泵和電源，主體上方采用鋼絲網(wǎng)頂面以固定保護(hù)罩[3]。采用硬質(zhì)塑料的1個(gè)圓筒作為其保護(hù)裝置，在另一側(cè)的筒壁做出與小鼠頭部相等大的一個(gè)圓孔，以便露出小鼠頭部。爆發(fā)出的壓力數(shù)據(jù)由壓力感應(yīng)器測量，數(shù)據(jù)的采集通過連接數(shù)據(jù)線將數(shù)據(jù)傳至電腦終端。

1.2.3 小鼠bTBI模型的建立 保護(hù)艙內(nèi)放置小鼠， bTBI模型組小鼠采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。將小鼠的頭后部露出來，鋁膜(1.4 mm)放置在中間，再將艙內(nèi)小鼠固定在鋼絲網(wǎng)上。電源連接后用壓縮空氣，大于鋁膜承受的壓力最大值時(shí)，發(fā)生破裂，其中爆發(fā)的巨大沖擊波力量沖擊到小鼠頭部正上方。爆炸后，需要對小鼠實(shí)施搶救，抬高小鼠下頜使其正常呼吸，存活小鼠送至飼養(yǎng)室內(nèi)正常喂養(yǎng)。正常對照組僅予以麻醉處置，在相同的時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本，進(jìn)行病理檢測。

1.2.4 Morris水迷宮 將圓形池內(nèi)裝滿水，黑色池壁。采用食用白色素使水不透明，并維持恒溫(22℃±1℃)。將水池劃沿順時(shí)針方向分4個(gè)象限，同時(shí)將平臺放置在第4個(gè)象限中。小鼠的游泳路徑采用池上的電子攝像機(jī)拍攝并系統(tǒng)分析跟蹤[4]。逃逸潛伏期是小鼠找到平臺所用時(shí)間的均值[5-6]。建模成功后7 d，兩組小鼠均以頭朝壁的方向放入水池，放入位置為隨機(jī)選取的4個(gè)象限起點(diǎn)，記錄進(jìn)入水下平臺的次數(shù)。這期間每天訓(xùn)練4次，訓(xùn)練共7 d，每次訓(xùn)練的間隔時(shí)間為20 min。將逃逸潛伏期和穿越平臺次數(shù)作為其認(rèn)知能力和空間記憶能力的判定指標(biāo)。

1.2.5 HE染色及病理變化 將固定好的腦組織進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋和切片，厚度2 μm。首先脫蠟、水化石蠟切片，通過染色試劑盒進(jìn)行HE染色，酒精分化選用1%鹽酸持續(xù)3 s，再用自來水持續(xù)處理5 min。返藍(lán)后，采用伊紅染色，最終在顯微鏡下觀察小鼠腦組織的病理改變情況[7-9]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 成功建立小鼠爆震傷模型，1周后注射10%水合氯醛將小鼠麻醉，眼球放血后將小鼠處死。10%的甲醛溶液固定小鼠的腦組織(每組各5只)，應(yīng)用HE病理染色、蛋白檢測，將每組中其余的5只小鼠的腦組織放至液氮罐里[10]，取腦組織置于冰上融化后，離心取其上層的蛋白溶液，測定其中的蛋白濃度后予以配平。在TBST(含0.05% Tween-20)中封閉1 h，再分別用S-100β、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體及鼠抗GAPDH單克隆抗體于4℃下孵育過夜。TBST漂洗3次，二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光檢測，凝膠成像采集圖像[11]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的行為學(xué)改變 建模后，bTBI模型組小鼠無死亡。建模3 h內(nèi)，小鼠均清醒，行動較遲緩，4 h小鼠進(jìn)食、水，活動速度有所增加，但與正常對照組相比較，活動較遲緩。

2.2 兩組小鼠的認(rèn)知能力及空間記憶能力比較 建模后7、14 d，bTBI模型組小鼠進(jìn)入平臺的次數(shù)分別為(1.33±0.15)、(2.50±0.14)次，均明顯少于正常對照組的(1.71±0.12)、(3.35±0.21)次，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。建模后7、14 d，正常對照組小鼠找到平臺位置的時(shí)間為(27.80±1.23)、(19.49±1.32)s，均明顯短于bTBI模型組的(38.82±3.21)、(26.43±2.41)s，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠的活動軌跡顯示，正常對照組小鼠圍繞平臺的活動軌跡較規(guī)律，bTBI模型組的活動軌跡相對較分散。見圖1。

2.3 兩組小鼠的腦組織變化情況比較 解剖后，bTBI模型組小鼠的腦組織邊緣較鈍，組織邊緣棱角不清晰，有明顯的水腫表現(xiàn)；正常對照組腦組織體積明顯縮小，組織邊緣清晰，可見明顯的血管及組織結(jié)構(gòu)。見圖2。

2.4 兩組小鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元比較 正常對照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則，無損傷；實(shí)驗(yàn)小鼠的腦組織中海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生了變性，同時(shí),錐體細(xì)胞發(fā)生腫脹且不規(guī)則排列。見圖3。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果 bTBI模型組小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)s100β、NSE和MBP的表達(dá)量均顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

目前，由于反裝甲武器的大范圍使用，裝甲車以及坦克乘員頻繁遇到閉合空間以內(nèi)的爆炸傷，在現(xiàn)代城市作戰(zhàn)中,閉合空間內(nèi)往往發(fā)生爆炸傷。此外，在和平時(shí)期，恐怖分子針對閉合空間以內(nèi)實(shí)施爆炸襲擊亦時(shí)有發(fā)生。對于此類事件研究較多的是創(chuàng)傷性以及開放空間的顱腦外傷和爆炸傷。然而，針對閉合空間以內(nèi)的bTBI相關(guān)研究較少。顱腦爆震傷是指爆震所產(chǎn)生的沖擊波致大氣壓急速改變，最終對顱腦形成沖擊性損傷[11]。頭部外傷在眾多爆炸傷中占較大比例[12]。

本研究結(jié)果顯示，bTBI模型組小鼠的腦組織邊緣較鈍，棱角不清晰，有明顯水腫表現(xiàn)，而正常對照組小鼠的腦組織體積明顯縮小，邊緣清晰，能看見明顯血管及組織結(jié)構(gòu)。這表明，正常對照組小鼠的海馬區(qū)分布較為規(guī)律，且?guī)缀鯖]有發(fā)生損傷,bTBI模型組小鼠的海馬區(qū)則出現(xiàn)神經(jīng)元變性。有研究通過建立顱腦爆震傷模型，在傷后24 h行頭顱MRI檢查,結(jié)果病理學(xué)提示，組織出現(xiàn)不同程度水腫[13]。扶宇等[14]通過建立小鼠bTBI模型，觀察爆炸后小鼠的存活率以及其大腦神經(jīng)元等發(fā)生變化的程度，采用HE染色法觀察爆震傷后小鼠的大腦組織的病理變化情況，結(jié)果表現(xiàn)為染色數(shù)目逐漸降低，神經(jīng)元胞體逐漸水腫[15-16]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，血清或腦脊液中S-100β水平與神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性，其可作為顱腦損傷標(biāo)志物，并且逐步推向臨床研究中[17]。另有研究顯示，大腦中仍存在尚未完全死亡或尚未完全喪失功能的神經(jīng)元細(xì)胞，而根據(jù)大腦可塑性這一理論，借助神經(jīng)元細(xì)胞對信號的解碼以促進(jìn)腦組織分泌生物活性等物質(zhì)，使機(jī)體適應(yīng)其病理學(xué)改變[17]。

通過顱腦爆震傷動物模型可研究其病理變化過程，但其爆震的可控度及精確度尚不明確，有待進(jìn)一步研究。bTBI可降低小鼠的認(rèn)知能力、損傷小鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元等。通過建立bTBI早期篩選評估模型可知，檢測大腦標(biāo)志物s100β、NSE和MBP的表達(dá)變化，有助于對早期bTBI進(jìn)行快速篩選識別。