蘇智宏 黎圣金 田長恩 周玉萍

植物鈣調(diào)素和類鈣調(diào)素是細胞內(nèi)最重要的一類Ca2+感受器，CaM/CML 通過與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞生理過程[1]。擬南芥有4 個CaM 蛋白和50 個CML 基因，干旱脅迫下類鈣調(diào)素CML37 突變體積累的ABA含量顯著低于野生型，表明CML37 正向調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，參與JA和ABA信號調(diào)節(jié)[2]。擬南芥IQM4 是一個Ca2+不依賴型鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，通過參與ABA合成調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)，但IQM4 上游CaM 或CML尚未鑒定[3]。在通過酵母雙雜交實驗來研究CML37 與IQM4 的相互作用時，觀察到轉(zhuǎn)化了pGBKT7- CML37 和pGADT7 質(zhì)粒的酵母菌在四缺培養(yǎng)基(SD- Ade/His/Leu /Trp)上正常生長并激活了報告基因LacZ 的表達。同時，酵母單雜交實驗也證實了擬南芥類鈣調(diào)素CML37 具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥為Columbia 生態(tài)型；大腸桿菌為E.coli DH5α；酵母雙雜交系統(tǒng)為Clontech公司的Matchmaker Gal4 Two- Hybrid System3；Carrier DNA 購自Sigma 公司；實驗所使用的膠回收試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PRIMER STAR 高保真DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶均為TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥CML37 與IQM4 基因克隆

從TAIR 數(shù)據(jù)庫獲取CML37 和IQM4 的CDS 序列，分別設(shè)計克隆引物。以擬南芥cDNA 為模板，利用PRIMERSTAR 高保真DNA 聚合酶進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 酵母表達載體構(gòu)建

PCR 產(chǎn)物分別用DNA 片段純化試劑盒純化后，其中AD- CML37 片段用EcoR I 和BamH I 定向插入酵母表達載體pGADT7 質(zhì)粒，BD- CML37 片段用EcoR I 和Pst I 定向插入pGBKT7 質(zhì)粒，而IQM4 片段用Nde I 和Xma I 分別定向插入pGADT7 和pGBKT7 質(zhì)粒。4 種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細胞，涂布至含相應(yīng)抗生素的LB 固體培養(yǎng)基（pGADT7 為氨芐青霉素抗性；pGBKT7為硫酸卡那霉素抗性），使用克隆用引物直接菌落PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)化子并送至華大公司測序證實。

1.2.3 酵母單雜交分析

采用PEG/LiAC 法將BD- CML37 和BD 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞AH109（圖1），涂布于SD- Trp；將AD- CML37和AD 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞并涂布于SD- Leu，30℃培養(yǎng)4 d 至菌落形成。從SD- Trp 平板上挑取長勢良好的單菌落接種于SD- Ade/His/Trp，從SD- Leu 平板挑取長勢良好的單菌落接種于SD- Ade/His/Leu，30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

2 結(jié)果

2.1 擬南芥CML37 與IQM4 基因克隆及載體構(gòu)建

擬南芥CML37 的CDS 序列長558bp，IQM4 的CDS 序列長1599bp，克隆產(chǎn)物經(jīng)PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳后，得到的條帶符合預(yù)期。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，采用菌落直接PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送至華大公司測序，測序結(jié)果證明CML37、IQM4 基因序列內(nèi)部沒有發(fā)生改變。

2.2 酵母雙雜交分析

前期酵母雙雜交實驗結(jié)果表明，含有AD- IQM4+BD- CM L37 和AD+BD- CML37 質(zhì)粒組合的酵母菌不僅在四缺培養(yǎng)基上正常生長，還能分解X- α- gal 產(chǎn)生藍色菌落；但AD- CML 37+BD- IQM4 質(zhì)粒組合的酵母不能在四缺培養(yǎng)基上生長。結(jié)果表明：在酵母細胞內(nèi)，CML37 不能與IQM4 蛋白相互作用，BD- CML37 融合蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子功能，而AD- CML37 不具備轉(zhuǎn)錄因子功能。

2.3 酵母單雜交分析

酵母單雜交實驗中將AD- CML37 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞后，涂布于SD- Leu 上培養(yǎng)4d 后，將轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)接到SD- Leu/His/Ade 上繼續(xù)培養(yǎng)4d 后沒有觀察到酵母菌落（圖1A）；將BD- CML37 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞后，涂布于SD- Trp 上培養(yǎng)4d 后，挑取篩選培養(yǎng)基上的酵母接種另一種三缺培養(yǎng)基SD- Trp/His/Ade 上繼續(xù)培養(yǎng)4d 后觀察到酵母菌落（圖1B）。轉(zhuǎn)化有BD- CML37 質(zhì)粒的酵母菌能夠在三缺培養(yǎng)基上生長，但轉(zhuǎn)化AD- CML37 質(zhì)粒的酵母菌不能生長。酵母單雜交分析表明，擬南芥CML37 蛋白缺少DNA 結(jié)合活性，但具有激活活性；在酵母細胞中，CML37 與BD（DNA 結(jié)合域）融合后具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。

圖1 CML37 的酵母單雜交分析

3 結(jié)論和討論

酵母雙雜交技術(shù)交廣泛應(yīng)用于蛋白分子之間相互作用的研，酵母單雜交實驗?zāi)軌驊?yīng)用于驗證轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合活性和自激活活性[4]，擬南芥CML37 蛋白有3 個EF- hand 基序，沒有其他功能結(jié)構(gòu)域，但酵母雙雜交和單雜交分析都證明CML37具有轉(zhuǎn)錄激活功能，說明CML37 基因功能研究還存在未認識的問題。