李瑩瑩, 王丁一, 農(nóng)騏郢, 劉麗紅, 張 蒙,梁 勇,3, 胡立剛*, 何 濱, 江桂斌

(1. 江漢大學環(huán)境與健康研究院, 湖北 武漢 430056; 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室, 北京 100085; 3. 持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430056)

快速、便攜、經(jīng)濟型的現(xiàn)場檢測是環(huán)境監(jiān)測、污染治理和疾病預(yù)防與控制等的關(guān)鍵步驟。隨著分析化學、儀器儀表學、材料科學、生物化學以及生物工程學等方面技術(shù)的進步,儀器的微型化受到越來越多的關(guān)注[1-4]?？茖W儀器的微型化,可以滿足資源有限條件下進行快速檢測的需求。在分析檢測領(lǐng)域已經(jīng)有多種開發(fā)完善的微型化儀器,如微型高速毛細管電泳儀[5-7]、微芯片臨床生化分析儀[8-10]、微型離心免疫分析儀[11]和微型高效液相色譜等[12,13]。便攜式分析儀器如移動酸堿度計、移動電化學檢測和便攜式光譜儀等也已被開發(fā)并投入市場使用。

目前,凝膠電泳(GE)技術(shù)是蛋白質(zhì)研究中實現(xiàn)其有效分離的重要技術(shù)手段[14-16]。凝膠電泳技術(shù)以其分辨率高、重復性好和易操作等優(yōu)點,被廣泛地應(yīng)用于分子生物學、生物化學、病理學和微生物學等學科的研究中[17-19]。例如之前研究[20]中設(shè)計的連續(xù)流動凝膠電泳與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用(GE-ICP-MS)的金屬蛋白質(zhì)在線分析系統(tǒng),其在金屬蛋白質(zhì)的在線分離和檢測方面表現(xiàn)出良好的性能。同時,凝膠電泳技術(shù)對于臨床檢測中蛋白質(zhì)的分離檢測具有重要意義。在資源少、實驗室設(shè)備和技術(shù)專長有限的環(huán)境中,將簡單、廉價和快速的制造用于診斷檢測的設(shè)備,有助于節(jié)約資源,降低成本。至今,凝膠電泳系統(tǒng)均屬于實驗室內(nèi)使用儀器,體積較大,不便于攜帶,無法用于蛋白質(zhì)樣品的現(xiàn)場檢測以及戶外使用。因此,開發(fā)穩(wěn)定、便攜式凝膠電泳系統(tǒng)對于現(xiàn)場檢測中的蛋白質(zhì)分析具有實際意義。

與傳統(tǒng)制造工藝不同,3D打印加工更快速、準確,為低成本地加工復雜的系統(tǒng)提供了方便、可靠的方法。該技術(shù)的巨大優(yōu)勢使其在近幾十年得到快速發(fā)展,并被應(yīng)用于許多領(lǐng)域[21-31]。隨著小型3D打印機的出現(xiàn)、打印材料種類的增加和相應(yīng)成本的降低,3D打印逐漸被應(yīng)用于更多的實驗室,制造越來越多的滿足分析化學和環(huán)境科學研究需求的定制設(shè)備[32,33]。例如,利用3D打印開發(fā)和加工微流體芯片和芯片實驗室[34-38]。這些研究表明,3D打印在裝置微型化的設(shè)計制造中具有廣闊的應(yīng)用空間。

本研究中開發(fā)了一種便攜式凝膠電泳分析系統(tǒng)。所設(shè)計的便攜式凝膠電泳裝置主要在實驗室內(nèi)通過3D打印加工。通過對預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準的分離,證實此裝置可在短時間內(nèi)實現(xiàn)不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的快速分離,并具有良好的分離性能。結(jié)合快速的蛋白質(zhì)凝膠條帶染色技術(shù),展現(xiàn)了潛在的現(xiàn)場應(yīng)用潛力。開發(fā)的便攜式凝膠電泳裝置由桌面3D打印機可在5 h內(nèi)制作完成,材料總成本小于400元人民幣。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

碳酸酐酶(CA)、卵白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白(CB)、核糖核酸酶A(RA)、預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準(Precision Plus ProteinTMDual Color Standards)、三(2-羰基乙基)磷酸鹽(TCEP)、十二烷基硫酸鈉(SDS),N,N,N′,N′-四亞甲基二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Sigma-Aldrich公司。甘氨酸(glycine)、30%丙烯酰胺溶液(acrylamide)購自美國VWR國際有限公司。甘油購自美國Affymetrix公司。0.5 mol/L的三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl, pH 6.8)和1.5 mol/L的Tris-HCl(pH 8.8)購自美國Bio-rad公司。無水乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)購自國藥集團化學試劑有限公司。One-Step BlueTM蛋白質(zhì)凝膠染料購自美國Biotium公司。3D打印光固化樹脂購自美國Formlabs公司。去離子水(18.2 MΩ·cm)由美國Millipore超純水系統(tǒng)Milli-Q制備。所用試劑均為分析純。

儀器:Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國), Form2 3D打印機(Formlabs公司,美國),凝膠成像儀(UMAX PowerLook2100XL-USB,立廣電腦), 25 V恒壓鋰電池(容量:2 000 mAh,浩博電子有限公司)。

溶液配制:CA、OVA、BSA、CB、RA蛋白質(zhì)儲備液(10 mg/mL)于-20 ℃避光儲存;上樣緩沖溶液:0.125 mol Tris(pH 6.8)+50%(v/v)甘油+8%(w/v)SDS+4%(v/v)β-巰基乙醇+0.04%(v/v)溴酚藍;電泳緩沖溶液:25 mmol Tris(pH 8.3)+192 mmol glycine+0.1%(v/v)SDS;分離前,5種標準蛋白質(zhì)混合樣品(0.1 mg/mL)與上樣緩沖溶液按照體積比1∶3混合,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1凝膠電泳裝置的設(shè)計和制造

便攜式凝膠電泳裝置采用計算機輔助設(shè)計軟件SolidWorks 2017 (Dassault Systemes SE,法國)進行設(shè)計。設(shè)計的主要組件包括凝膠電泳槽、凝膠管(板)。具體設(shè)計制造過程如下:凝膠電泳槽的尺寸最大為50 mm×20 mm×30 mm。凝膠管內(nèi)徑2.2 mm,外徑4.0 mm,長30 mm。水平凝膠板長25 mm,寬7.5 mm,凝膠厚1.5 mm。加樣孔寬4 mm,長1.5 mm。設(shè)計的凝膠電泳裝置數(shù)字模型生成.stl格式的文件,并傳輸至PreForm軟件(Formlabs公司)進行切片,在軟件中對模型進行設(shè)置,選擇合適的放置角度。設(shè)置打印參數(shù):打印機選擇form2,打印材料選擇clear,打印精度0.1 mm;為防止影響模型使用,在參數(shù)設(shè)置中取消打印模型內(nèi)部支撐的設(shè)置,保留外部支撐。在軟件內(nèi)完成參數(shù)設(shè)置后即可將模型傳輸至Form2 3D打印機開始打印。所有設(shè)計、打印時間均在10 h內(nèi)完成,耗費材料均在10 mL以內(nèi)。打印完成后,從打印平臺去除模型,去除外部支撐,之后用無水乙醇對除去支撐后的模型進行清洗,防止多余的樹脂材料殘存。采用直徑0.1 mm、長約4 cm的鉑絲作為正、負極緩沖溶液槽的電極。

1.2.2電泳裝置性能測試

首先采用預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準對不同設(shè)計的便攜式凝膠電泳裝置的分離性能進行測試。兩種十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠比例用于預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準的分離。凝膠比例1: 5 mm長度的濃縮膠濃度為4%, 15 mm長度的分離膠濃度為10%;凝膠比例2: 5 mm長度的濃縮膠濃度為4%, 15 mm長度的分離膠濃度為15%。不同濃度凝膠配方見表1。

觀察兩種凝膠比例對于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準的分離效果,選擇較好的一組進行不同濃縮膠和分離膠長度比例的分離效果比較,分離膠長度選擇5、10、15、20 mm。為有效觀測蛋白質(zhì)條帶,所有分離預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準上樣量均為10 μL。選擇其中分離性能最好的一組進行后續(xù)的5種標準蛋白質(zhì)分離,與Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)的分離效果進行對比。上述蛋白質(zhì)分離實驗均進行多次重復實驗。

表 1 SDS-PAGE膠詳細配方

柱狀凝膠制膠方式:首先采用注射器將分離膠注入凝膠管內(nèi),然后在已注入分離膠的凝膠管內(nèi)注入去離子水,待分離膠凝固,將去離子水吸出,之后注入濃縮膠,最后加入去離子水進行水封,待用。板狀凝膠制膠方式:首先采用移液槍將分離膠注入凝膠板之間的空隙中,然后在已注入分離膠的凝膠板內(nèi)注入去離子水,待分離膠凝固將去離子水吸出,之后注入濃縮膠,最后將梳子插入凝膠板,待用。制膠前,在所有凝膠管(板)外部標記灌膠高度,凝膠管(板)均用封口膜固定密封。

便攜式凝膠電泳運行條件:恒壓25 V至分離結(jié)束。

Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)運行條件:60 V, 30 min; 100 V直至分離結(jié)束。

染色:5種標準蛋白質(zhì)分離結(jié)束后,將凝膠從凝膠板上卸下。用One-Step BlueTM蛋白質(zhì)凝膠染料(產(chǎn)品檢出限:10～20 ng)對蛋白質(zhì)條帶進行染色。染色程序按產(chǎn)品說明書進行:將未固定的凝膠放入盛有25 mL One-Step BlueTM溶液的干凈容器中,在搖床上常溫孵育凝膠10～60 min,顯色即可。

2 結(jié)果與討論

2.1 裝置設(shè)計和優(yōu)化

在此前的工作中,我們已經(jīng)采用3D打印開發(fā)了用于金屬結(jié)合蛋白分離的凝膠電泳裝置[20],驗證了3D打印凝膠電泳裝置的可行性,但是該裝置體積大,不便于攜帶。我們借鑒之前研究中凝膠電泳裝置的電泳槽結(jié)構(gòu),設(shè)計了一個微型化的水平凝膠電泳裝置,用于現(xiàn)場對蛋白質(zhì)進行快速分離。所設(shè)計的凝膠電泳裝置主要由3部分組成:凝膠管(板)、凝膠電泳槽和電池。其中凝膠管(板)和凝膠電泳槽的主體通過實驗室內(nèi)的一臺桌面級3D光固化打印機進行加工制造,整個制造過程可在短時間內(nèi)完成,并能快速進行優(yōu)化和改進。

圖 1 電泳槽設(shè)計圖及實物圖Fig. 1 Design drawings and physical drawings of electrophoresis tanks a. Design A: double gel channel horizontal column electrophoresis tank; b. Design B: signal gel channel horizontal column electrophoresis tank; c. Design C: single gel channel horizontal column positive and negative electrophoresis tank; d. Design D: single gel channel horizontal slab positive and negative electrophoresis tank.

為使電泳裝置結(jié)構(gòu)更合理、使用更加方便,我們對電泳槽的幾何結(jié)構(gòu)和參數(shù)進行了多次測試和優(yōu)化。我們首先設(shè)計了包含雙凝膠通道(設(shè)計A,見圖1a)和單凝膠通道(設(shè)計B,見圖1b)兩種結(jié)構(gòu)的電泳槽。設(shè)計A與設(shè)計B均采用兩種凝膠比例對標準蛋白質(zhì)進行了分離,所用標準蛋白質(zhì)為相對分子質(zhì)量從10 kD到250 kD的商業(yè)化預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準,分離結(jié)果如圖2a-d所示。設(shè)計A分離時間5 h,設(shè)計B分離時間2 h。同一設(shè)計在相同分離時間內(nèi),15%濃度分離膠未能將10、15、20 kD的蛋白質(zhì)完全分離,且10%濃度凝膠的整體分離效果均優(yōu)于15%濃度凝膠的整體分離效果,因此我們選擇10%濃度的分離膠開展接下來的實驗。分離相同蛋白質(zhì)時,設(shè)計A所需時間明顯長于設(shè)計B,可能是由于設(shè)計A采用雙通道設(shè)計,分散了電流的強度,導致蛋白質(zhì)在電場中移動減慢,分離時間增加。設(shè)計B雖然分離時間較短,但實驗過程中易產(chǎn)生正、負極電泳緩沖溶液相互滲透的現(xiàn)象,所以結(jié)構(gòu)需要進一步的優(yōu)化。

圖 2 水平凝膠電泳槽的性能Fig. 2 Performance of the horizontal gel electrophoresis tank a. Design A, concentrated gel: 4%, separating gel: 15%; b. Design A, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; c. Design B, concentrated gel: 4%, separating gel: 15%; d. Design B, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; e. Design C, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; f. Design D, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%.

為此,我們將電泳槽結(jié)構(gòu)改為正、負緩沖溶液槽分離的設(shè)計C(見圖1c);采用設(shè)計C的電泳槽電泳緩沖溶液不會相互滲透,且其完全分離標準蛋白質(zhì)的時間縮短至1.5 h左右(見圖2e),與設(shè)計B相比分離時間縮短。然而在實驗的過程中,柱狀的凝膠不便于樣品上樣以及分離結(jié)束后對蛋白質(zhì)條帶進行染色。因此,我們在設(shè)計C的基礎(chǔ)上,用平板凝膠代替柱狀凝膠,并在凝膠板之上設(shè)置加樣孔(寬4 mm,長1.5 mm),實現(xiàn)垂直加樣,如圖1d所示(設(shè)計D)。設(shè)計D完全分離標準蛋白質(zhì)只需要1 h左右,從分離時間和分離之后蛋白質(zhì)條帶易于染色觀察方面來看,設(shè)計D優(yōu)于其他3種設(shè)計(見圖2f),設(shè)計D的體積也最小,正、負極電泳緩沖溶液共需4 mL,在進行多個樣品測試時可將設(shè)計D的多個電泳槽并聯(lián)使用。

在優(yōu)化電泳槽的結(jié)構(gòu)之后,我們對凝膠的長度進行了優(yōu)化。我們將多個設(shè)計D的電泳槽并聯(lián)使用,分別裝載不同長度的分離膠,同時對預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準進行分離測試,結(jié)果如圖3所示。圖3a的凝膠僅含10%濃度的分離膠,長度為20 mm;圖3b-d的凝膠中含10%濃度分離膠和4%濃度濃縮膠,分離膠的長度分別為15、10和5 mm,濃縮膠長度均為5 mm。對比4種不同長度分離膠的分離結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn),使用長度為5 mm的分離膠即可將預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準完全分離,雖然各個蛋白質(zhì)的條帶較緊湊,但能夠區(qū)分所有條帶,且相對分子質(zhì)量相差較大(如10、50、100 kD)的蛋白質(zhì)之間的距離較大,足以滿足便攜式現(xiàn)場測試的需求,且整個分離時間最短只需要20 min。

圖 3 水平平板凝膠電泳采用不同長度10%分離膠分離蛋白質(zhì)Fig. 3 Protein separation on a horizontal slab gel with 10% separation gel of different lengtha. 20 mm; b. 15 mm; c. 10 mm; d. 5 mm.

2.2 電源的優(yōu)化

商業(yè)化凝膠電泳裝置的電源尺寸較大,且需220 V交流電供電,無法便攜式使用。鋰電池尺寸較小,方便攜帶,且可根據(jù)需要對電壓進行定制。因此,為了保證安全性,在本研究中我們采用固定工作電壓為25 V的鋰電池作為整個裝置的電源。該鋰電池整體尺寸為70 mm×60 mm×40 mm。在工作電壓為25 V時,該鋰電池可支持同時進行多個電泳槽并聯(lián)使用,且可持續(xù)工作100 h。

2.3 裝置性能的測試

實驗室常用銀染、熒光染色等方法使蛋白質(zhì)條帶顯色。但這些方法使用試劑較多,步驟繁瑣且耗時較長,無法方便地在戶外進行應(yīng)用。所以我們采用了一種更便捷的一步染色方法,使蛋白質(zhì)條帶顯色。該方法只需要使用One-Step BlueTM蛋白質(zhì)凝膠染料,將分離完成后的蛋白質(zhì)凝膠浸沒于染液中,即可對分離的蛋白質(zhì)條帶進行染色(染液對蛋白質(zhì)進行10～60 min的染色,蛋白質(zhì)條帶可見即可停止染色)。使用該方法對商用平板凝膠電泳裝置進行標準蛋白質(zhì)分離染色后,分別采用凝膠成像儀和手機對染色的條帶進行拍攝,結(jié)果如圖4a、4b所示。兩種不同拍攝方式得到的蛋白質(zhì)條帶均清晰可見,說明該染色方法不僅可以在實驗室內(nèi)用專用實驗設(shè)備進行實驗結(jié)果的保存,同時也可以在實驗條件不便時用手機對實驗結(jié)果進行保存,且成像效果相差無幾。表明該方法可用于現(xiàn)場對蛋白質(zhì)的分離結(jié)果進行觀測。

圖 4 One-Step BlueTM蛋白質(zhì)顯色效果以及標準蛋白質(zhì)混合樣品的分離應(yīng)用Fig. 4 Effect of One-Step BlueTM protein staining and the application of mixed standard protein sample separation a. UMAX PowerLook2100XL-USB shooting; b. mobile phone shooting; c. 15 mm 10% separation gel with UMAX PowerLook2100XL-USB; d. 15 mm 10% separation gel with mobile phone. Standard proteins: carbonic anhydrase (CA), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), conalbumin (CB), ribonuclease A (RA).

根據(jù)之前的實驗結(jié)果,5 mm凝膠長度適用于寬相對分子質(zhì)量范圍的蛋白質(zhì)分離檢測。對于13～76 kD的窄相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),我們采用設(shè)計D,裝配包含5 mm 4%濃度濃縮膠和15 mm 10%濃度分離膠的凝膠,對5種標準蛋白質(zhì)混合溶液樣品進行分析,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.1 mg/mL,上樣量10 μL。其結(jié)果如圖4c、4d所示,使用這種便攜式的凝膠電泳裝置,相對分子質(zhì)量范圍在13～76 kD的5種標準蛋白質(zhì)可以在40 min左右分離完成,且染色結(jié)果清晰可見,表明此裝置可有效地用于蛋白質(zhì)的便攜式現(xiàn)場分離和檢測。

該便攜式凝膠電泳裝置與商業(yè)化常規(guī)平板凝膠電泳槽相比,后者所需電泳緩沖溶液約500 mL,分離不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標準至少需要4 h。而該便攜式凝膠電泳槽的尺寸僅為15 mm×20 mm×17 mm,需電泳緩沖溶液4 mL左右,分離時間40 min左右,能夠更有效地應(yīng)用于便攜式檢測的場景中。

3 結(jié)論

本研究設(shè)計加工了一種便攜式凝膠電泳裝置。該裝置具有尺寸及容積小、電泳緩沖液用量少、分離快速、便攜等特點,可用于蛋白質(zhì)的現(xiàn)場分析和檢測。值得注意的是,本系統(tǒng)可以多個電泳槽并聯(lián)使用,同時分析更多樣品。與商用平板凝膠電泳相比,本實驗裝置優(yōu)勢在于:(1)采用鋰電池替代常規(guī)220 V電源,可用于戶外檢測;(2)分析相同的預(yù)染蛋白質(zhì)所需時間更短,且分離效果相當;(3)作為核心分離單元的水平平板凝膠電泳裝置主要采用3D打印技術(shù)制作,方便快捷,成本低廉。3D打印作為實驗室研發(fā)手段,可基于數(shù)字化的原型將所研發(fā)的儀器組件進行快速修改和優(yōu)化,并在實驗室內(nèi)部或?qū)嶒炇抑g實現(xiàn)低成本、快速、精確的制造和復制,這也凸顯了3D打印對于小型分析儀器開發(fā)的強大優(yōu)勢和應(yīng)用前景。隨著3D打印機精度、材料替代品的增加,越來越多的實驗裝置可通過3D打印技術(shù)實現(xiàn)微型化和便攜化。