郭常川, 劉 琦, 張 雷, 鄭 靜, 汪 勇, 楊書娟, 褚志杰, 牛 沖, 徐玉文*

(1. 山東省食品藥品檢驗研究院, 山東 濟南 250101; 2. 島津企業(yè)管理(中國)有限公司, 北京 100020; 3. 山東省中醫(yī)院, 山東 濟南 250014)

N-亞硝基二甲胺(NDMA)又名N-二甲基亞硝胺,具有很強的肝毒性,ICH M7 (R1)指南明確指出該化合物具有較高的致癌性[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的致癌物清單,NDMA屬于2A類致癌物質(zhì)[2]。自2018年以來,國內(nèi)外多家藥企都曾因纈沙坦、雷尼替丁產(chǎn)品中檢出超限量的NDMA而陷入風(fēng)波。2019年12月,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)開始調(diào)查已批準(zhǔn)在美國銷售的二甲雙胍中的NDMA含量,并將酌情建議召回。隨后,歐洲、加拿大、新加坡及我國藥品監(jiān)管部門也陸續(xù)對轄區(qū)內(nèi)二甲雙胍中NDMA的含量情況展開調(diào)查。2020年5月8日,國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》。

目前,NDMA的檢測方法主要有表面增強拉曼散射法(SERS)[3]、分子印跡聚合物電化學(xué)法[4]、HPLC-化學(xué)發(fā)光法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[6,7]、氣相色譜-熱能分析法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-13]等,主要應(yīng)用于食品(飲用水、水產(chǎn)品、肉制品等)、化妝品和煙草行業(yè)。國內(nèi)外關(guān)于藥品中NDMA檢測的研究較少,目前僅檢索到纈沙坦、厄貝沙坦、吉非替尼中NDMA測定的文獻[14-17],未見有針對二甲雙胍中NDMA檢測的報道。但測定其他藥物中NDMA的文獻不能直接應(yīng)用于鹽酸二甲雙胍中NDMA的測定,這是因為藥物主成分理化性質(zhì)不同,導(dǎo)致提取方法、色譜保留均有差異,因此前處理方法、色譜條件不能通用,亟須重新開發(fā)方法。LC-MS由于其靈敏度高、選擇性好的優(yōu)勢,在藥物雜質(zhì)或殘留分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[18]。本研究建立了用于測定鹽酸二甲雙胍原料藥(API)及其制劑中NDMA含量的LC-MS法,樣品前處理簡便快速,靈敏度高,專屬性強,重復(fù)性好,已用于鹽酸二甲雙胍API及其制劑中NDMA的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)包括LC-30AD高壓二元液相泵、CBM-20A通訊總控模塊、DGU-20A5R脫氣機、SIL-30AC自動進樣器、CTO-30A柱溫箱以及LCMS-8050質(zhì)譜儀,LabSolutions軟件用于控制和數(shù)據(jù)處理(Shimadzu公司,日本); Mettler XS205型電子天平(Mettler Toledo公司,瑞士); Heraeus Multifuge X1R型高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司,美國); KQ-500 DE型溫控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司); THZ-82型水浴恒溫振蕩器(常州金壇精達儀器制造有限公司); 2 mL一次性無菌注射器(山東新華安得醫(yī)療用品有限公司); 13 mm、0.22 μm微孔濾頭(上海安譜實驗科技股份有限公司)。NDMA對照品購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(含量>99.0%); HPLC級甲醇(純度99.9%)、甲酸(純度>99%)及超純水均購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)。86批鹽酸二甲雙胍原料藥、16批鹽酸二甲雙胍片劑、11批二甲雙胍格列本脲膠囊均為藥企委托檢驗提供。

1.2 實驗條件

1.2.1對照品溶液的制備

取NDMA對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋為1.0 mg/mL的NDMA對照品溶液;以水作為稀釋溶劑,逐級稀釋得到1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL的系列NDMA工作溶液。

1.2.2樣品前處理

取本品(原料、片、腸溶片)或本品內(nèi)容物(膠囊)(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg),精密稱定,置于50 mL離心管中,精密加入水10 mL,渦旋混勻1 min,再以350 r/min的頻率振蕩10 min,于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液即得(原料則無須過濾膜,取離心上清液即得)鹽酸二甲雙胍原料、片、腸溶片、膠囊供試品溶液。

1.2.3色譜條件

色譜柱：ACE EXCEL 3 C18-AR柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)；柱溫:40 ℃;自動進樣器溫度:10 ℃;流動相A:含0.1%甲酸的水溶液,流動相B:含0.1%甲酸的甲醇溶液;流速:0.8 mL/min。梯度洗脫程序:0～6.0 min, 5%B; 6.0～7.0 min, 5%B～90%B; 7.0～10.0 min, 90%B; 10.0～10.5 min, 90%B～5%B; 10.5～14.0 min, 5%B。進樣量:10 μL。六通閥切換設(shè)置:保留時間2.85～7.00 min流動相進入質(zhì)譜,其余時間流動相進入廢液。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源:大氣壓化學(xué)電離(APCI)源,正離子模式;監(jiān)測方式:MRM模式;接口溫度:300 ℃;脫溶劑管溫度:250 ℃;加熱塊溫度:400 ℃;霧化器流量:3 L/min;加熱器流量:10 L/min;干燥器流量:10 L/min。

NDMA定量離子對為m/z75.0→43.1,駐留時間為197.0 ms,預(yù)四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q1 Pre為-12.0 V,碰撞能量(CE)為-17.0 eV,預(yù)四級桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q3 Pre為-46.0 V; NDMA定性離子對為m/z75.0→58.2,駐留時間為197.0 ms, Q1 Pre為-16.0 V, CE為-16.0 eV, Q3 Pre為-24.0 V。

1.3 檢出量的計算

分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,按外標(biāo)法計算供試品中NDMA含量。NDMA檢出量(detected amount of NDMA,用ppm(10-6)表示)計算公式見公式1,

(1)

式中:Ai和As分別為供試品溶液和對照品溶液中NDMA的峰面積;CAPI為供試品溶液中鹽酸二甲雙胍的質(zhì)量濃度(mg/mL);Cs為NDMA對照品溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

NDMA相對分子質(zhì)量較小,母離子m/z僅為75.0。采用正離子模式進行質(zhì)譜檢測時,低質(zhì)荷比(尤其是m/z<100)的離子通常基線噪聲較大,影響色譜峰信噪比,造成低濃度檢測的困難。而根據(jù)NMPA暫定限度要求折算,本實驗NDMA定量限要低于1.60 ng/mL,且S/N≥10,對儀器靈敏度要求很高。因此,為實現(xiàn)NDMA的痕量檢測,本研究通過母離子掃描、子離子掃描等方式篩選出多組NDMA多反應(yīng)監(jiān)測離子對,再應(yīng)用Labsolution軟件優(yōu)化選擇出最佳離子對、碰撞能量及駐留時間,并對離子源氣流速、溫度、電壓進行詳盡優(yōu)化,最終實現(xiàn)了NDMA檢測的靈敏度要求。

2.1.2色譜條件優(yōu)化

樣品溶液中含有高含量的二甲雙胍(50.00 mg/mL)和痕量的NDMA(<100.00 ng/mL),在進行HPLC-MS檢測時,如果高含量二甲雙胍進入質(zhì)譜系統(tǒng),會污染離子源并產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應(yīng),會對NDMA測定造成很大影響。因此,應(yīng)使NDMA和二甲雙胍達到足夠的色譜分離度。實驗通過六通閥將二甲雙胍色譜峰處的流動相切換到廢液,避免高含量二甲雙胍進入質(zhì)譜。

本實驗最初考察100 mm×4.6 mm規(guī)格色譜柱,流速為0.5 mL/min,發(fā)現(xiàn)NDMA和二甲雙胍色譜分離較差,保留時間僅相隔1.2 min,對閥切換造成了困難。改用150 mm×4.6 mm規(guī)格色譜柱,流速增大為0.8 mL/min,優(yōu)化梯度洗脫條件使NDMA和二甲雙胍實現(xiàn)了較好的色譜分離。二甲雙胍色譜峰保留時間為2.24 min,出峰較早,于2.60 min左右回到基線,NDMA色譜峰保留時間約為4.40 min,通過六通閥控制僅將保留時間2.85～7.00 min的流動相進入質(zhì)譜系統(tǒng),有效避免了高含量API的基質(zhì)干擾,保護了離子源,使NDMA的測定更加準(zhǔn)確可靠。

此外,為進一步提高靈敏度,本實驗考察了進樣體積的影響,在不影響峰形的前提下,盡量增大進樣體積。實驗發(fā)現(xiàn)進樣體積大于10 μL時NDMA峰形開始變差,因此本實驗選定進樣量為10 μL。

2.1.3前處理方法優(yōu)化

NDMA易溶于水、醇,但二甲雙胍在水中易溶,在甲醇中溶解。實驗發(fā)現(xiàn),如果選用甲醇作為提取溶劑,則供試品溶液在自動進樣器10 ℃條件下放置1 h后即發(fā)生結(jié)晶析出的現(xiàn)象,系二甲雙胍在甲醇中過飽和所致,會堵塞進樣器和色譜柱。因此,本實驗選用水作為提取溶劑,使NDMA和二甲雙胍均能形成澄清透明的水溶液,再進行超聲提取、微孔濾過操作,前處理簡單,重復(fù)性好,回收率高。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1專屬性

將水、處理后的輔料溶液、NDMA對照品溶液、處理后的樣品(批號18120201)溶液分別進樣測定(見圖1)。結(jié)果表明,NDMA出峰時間約為4.40 min,相同保留時間處的溶劑及輔料溶液均無干擾峰,方法專屬性良好。

圖 1 水、輔料、NDMA及陽性樣品提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of H2O, excipients, NDMA and a positive sampleNDMA: N-dimethylnitrosamine.

2.2.2線性范圍

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣測定。以峰面積作為y, NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(ng/mL)作為x,不加權(quán)重擬合線性校正曲線,建立回歸方程,計算相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明,NDMA在1.00～100.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=20 232.50x-871.25,r=0.999 97。

2.2.3檢出限和定量限

精密移取1.00 ng/mL NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液,以水作為溶劑逐級稀釋,按信噪比S/N≥ 3和10計算檢出限和定量限。結(jié)果表明,方法的檢出限為0.20 ng/mL,定量限為1.00 ng/mL。

2.2.4回收率和精密度

根據(jù)NMPA對亞硝胺類雜質(zhì)限度要求以及鹽酸二甲雙胍說明書中規(guī)定的每日最大用藥量計算,鹽酸二甲雙胍原料含NDMA不得過0.032 ppm,鹽酸二甲雙胍制劑含NDMA不得過0.048 ppm[19]。本研究考察了低、中、高3個水平的NDMA在鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中的回收率和精密度。取已知陰性樣品約一次服用量(以鹽酸二甲雙胍計500.00 mg),原料藥及制劑皆精密稱取9份(低、中、高水平各3份),先分別精密加入適量的NDMA對照品溶液,后續(xù)操作按照1.2.2節(jié)描述處理,得到加標(biāo)回收試驗用供試品溶液。結(jié)果表明,低、中、高3個水平濃度下的NDMA在鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中的加標(biāo)回收率為94.55%～114.67%, RSD為4.73%～13.46%(見表1),符合藥典規(guī)定,表明NDMA回收率和重復(fù)性良好。

表 1 不同劑型中NDMA的加標(biāo)回收率(n=3)

2.2.5基質(zhì)效應(yīng)

分別制備低、中、高3個水平的空白基質(zhì)加標(biāo)溶液和對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進樣,計算空白基質(zhì)加標(biāo)溶液和對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液中NDMA峰面積之比,即為基質(zhì)效應(yīng)。NDMA在低、中、高3個水平下的基質(zhì)效應(yīng)為88.73%～103.61%,表明空白基質(zhì)不影響NDMA的質(zhì)譜測定。

2.2.6穩(wěn)定性

將1.00 ng/mL的NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于進樣瓶中,在自動進樣器中按照實驗條件放置0、8、24 h后進樣測定,NDMA峰面積的RSD為2.08%,說明該條件下NDMA在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 實際樣品檢測

對113批鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑處理后進樣測定,外標(biāo)法計算樣品中NDMA檢出量。根據(jù)NMPA制定的NDMA限度要求[19],原料藥NDMA含量均不超限,但有8批二甲雙胍制劑(含2批片劑、6批膠囊)超過了限度,其質(zhì)量濃度為3.59～14.10 ng/mL,檢出量為0.072～0.282 ppm。陽性樣品測定結(jié)果見表2。

表 2 陽性樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了鹽酸二甲雙胍中NDMA的HPLC-MS檢測方法,并進行了詳盡的方法學(xué)驗證，同時將方法應(yīng)用于鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中NDMA的測定。本方法靈敏度高,專屬性好,回收率高,線性范圍寬,操作簡便、可靠,已用于鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中NDMA檢驗工作,填補了該領(lǐng)域研究空白。本研究可以幫助企業(yè)進行生產(chǎn)工藝控制,并為藥監(jiān)部門的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。