曾 磊, 曹 宇, 姚興東, 李國祥, 雷福厚*, 史伯安*

(1. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 湖北 恩施 445000;2. 廣西民族大學(xué)廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室, 廣西 南寧 530006)

高效液相色譜作為一種高效的分析方法,被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生命科學(xué)和其他分析領(lǐng)域[1]。作為色譜分離的核心部分,色譜固定相材料的制備和應(yīng)用已成為色譜研究的前沿和熱點[2-5]。多孔硅膠基質(zhì)由于其較大的表面積、機械強度高、穩(wěn)定性好、制備簡單、粒徑可控等優(yōu)點,常用作色譜柱固定相[6-8]。為了滿足不同的分離需求,色譜研究者通常用硅烷偶聯(lián)劑對硅膠進行硅烷化改性,再將設(shè)計的色譜配體鍵合到硅烷化硅膠上以得到色譜固定相[9-12],從而制備一系列具有不同分離性能的色譜柱。

研究表明,天然化合物獨特的結(jié)構(gòu)使其具有作為色譜配體的能力,能用于相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的分離富集,并且由于其具有天然、低毒或無毒性質(zhì),人工合成配體無法達到這種效果[13-15]。生漆是我國特有的優(yōu)質(zhì)天然植物資源,對環(huán)境友好,可生物降解。漆酚是生漆的主要成分,是一種具有15或17個碳原子的烷基長側(cè)鏈的鄰苯二酚衍生物的混合物[16,17],側(cè)鏈的不飽和度為0～3,其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使漆酚可以發(fā)生還原[18]、取代[19]、自聚[20]、共聚[21]等反應(yīng)。目前生漆主要應(yīng)用于天然涂料,還未見到有關(guān)將漆酚作為色譜分離材料的報道。

在本工作中,以漆酚為原料制備了甲基丙烯酸漆酚酯混合物(UMA),并以UMA為色譜配體,3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷為硅烷偶聯(lián)劑,球形硅膠為基質(zhì),通過自由基聚合制備了漆酚酯鍵合硅膠固定相。制備出的固定相不僅具有長烷基側(cè)鏈,還具有苯環(huán)和酚羥基多個活性位點,對天麻和吳茱萸的主要活性成分表現(xiàn)出良好的分離性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet公司,美國); Vario EL cube型元素分析儀(EA, Elementar公司,德國); Z0050716型裝柱機(Scientific Systems公司,美國);不銹鋼色譜柱(250 mm×4.6 mm,大連依利特分析儀器有限公司); STA449F3熱重分析儀(耐馳公司,德國); LC-15C分析型高效液相色譜儀(島津公司,日本)。

生漆(湖北利川毛壩);球型硅膠(5 μm,蘇州納微科技公司);溴化鉀(光譜純,麥克林試劑公司); 3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(阿拉丁試劑公司),乙腈、甲醇(色譜純,賽默飛試劑公司);偶氮二異丁腈(AIBN)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、甲基丙烯酰氯、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)(阿拉丁試劑公司);天麻(湖北恩施),吳茱萸(廣西南寧),天麻素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品(分析標準品,≥98%,阿拉丁試劑公司)。三氯甲烷(TCM)、石油醚(PET,沸點60～90 ℃)、無水硫酸鈉、三乙胺(TEA)、甲苯等試劑均為國產(chǎn)分析純。

圖 2 漆酚酯鍵合硅膠固定相的合成路線Fig. 2 Schematic illustration of the urushiol methacrylate-bonded silica stationary phase (USP) EGDMA: ethyleneglycol dimethacrylate; AIBN: azodiisobutyronitrile; TCM: trichloromethane.

1.2 漆酚的提取

稱取20 g生漆溶于200 mL丙酮中,攪拌使其溶解。將混合液離心后取上層離心液,用丙酮將下層濾渣洗滌至白色,合并離心液。旋蒸濃縮,得到黃棕色油狀漆酚混合物12.85 g。

1.3 漆酚酯的制備

漆酚酯的制備過程如圖1。稱取5 g漆酚混合物于雙口燒瓶中,加入100 mL石油醚攪拌使其溶解。稱取3.40 g三乙胺和3.33 g甲基丙烯酰氯,分別置于恒壓分液漏斗中,在冰水浴條件下滴加到反應(yīng)體系中。滴加完畢后,升溫至40 ℃,在N2保護下回流反應(yīng)4 h,抽濾,收集濾液并用飽和食鹽水洗至中性,旋蒸濃縮后得到黃色油狀漆酚酯混合物。

1.4 硅烷化硅膠的制備

稱取10 g硅膠(5 μm)于單口燒瓶中,加入100 mL體積分數(shù)為10%的鹽酸溶液,攪拌均勻。升溫至70 ℃,在N2保護下回流反應(yīng)8 h,減壓抽濾并洗滌至中性后在80 ℃條件下真空干燥12 h制得活化硅膠;將活化硅膠置于單口燒瓶中,加入100 mL無水甲苯、4 mL無水吡啶及10 mL 3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,攪拌均勻,升溫至80 ℃,在N2保護下回流反應(yīng)8 h,冷卻至室溫,減壓抽濾并依次用丙酮、甲醇、正己烷洗滌至無吡啶味,最后真空干燥12 h,制備得到硅烷化硅膠。

1.5 漆酚酯鍵合硅膠固定相的制備

固定相的制備過程如圖2。分別稱取UMA 0.16 g、EGDMA 0.33 g、AIBN 3.00 mg和0.06 g異

圖 1 甲基丙烯酸漆酚酯合成示意圖Fig. 1 Synthesis of urushiol methacrylate (UMA)PET: petroleum ether; TEA: triethylamine.

辛烷，合并使其溶解于30 mL的三氯甲烷中得到混合溶液。將混合液超聲5 min使其分散均勻。然后將混合液均勻地涂覆到硅烷化硅膠表面。將涂覆后的硅膠均勻分散于100 mL質(zhì)量濃度為30 g/L的SDS水溶液中進行懸浮聚合。在85 ℃下回流反應(yīng)2 h,在95 ℃回流反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,抽濾并用無水乙醇進行索氏提取,得到漆酚酯鍵合硅膠固定相。

1.6 色譜柱的制備

在裝柱前,先將制備好的固定相過500目篩。采用勻漿法裝柱,以甲醇作為勻漿液,將4 g固定相加入58 mL甲醇中形成勻漿液。以無水乙醇為頂替液,在高壓下將固定相填充于不銹鋼色譜空柱(250 mm×4.6 mm)中。在60 MPa的壓力下裝柱15 min,在30 MPa的壓力下裝柱15 min。裝柱完成后,以甲醇為流動相,以0.1 mL/min的流速沖洗色譜柱至基線平穩(wěn),即制得漆酚酯鍵合硅膠色譜柱(USP柱),以甲醇為保護液保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基丙烯酸漆酚酯的紅外光譜

將漆酚與UMA用無水硫酸鈉脫水后,均勻涂在KBr鏡片上進行紅外光譜測試,結(jié)果如圖3,在3 480 cm-1處的吸收峰為酚羥基峰。酯化產(chǎn)物的酚羥基峰明顯減弱,說明酚羥基發(fā)生了反應(yīng),但由于側(cè)鏈的空間位阻較大未能將其全部封閉。在1 745 cm-1處有明顯的C=O雙鍵的伸縮振動峰,在1 123 cm-1處有明顯的C-O-C伸縮振動峰,說明酚羥基與甲基丙烯酰氯發(fā)生了取代反應(yīng),生成了漆酚酯。

圖 3 UMA與漆酚的紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of UMA and urushiol

2.2 漆酚酯鍵合硅膠的固定相表征

2.2.1元素分析

分別對硅膠、硅烷化硅膠和漆酚酯鍵合固定相中的C、H、O元素含量進行測定(見表1)。結(jié)果表明,硅烷化硅膠中C、H和O元素的含量分別增加至6.21%、1.25%和6.44%,說明成功制備出硅烷化硅膠。漆酚酯鍵合固定相的元素分析結(jié)果顯示,由于漆酚酯中含有C、H、O元素,使得其3種元素含量均有所增加,分別達到8.32%、1.63%和7.73%,證實了漆酚酯通過自由基聚合反應(yīng)成功聚合在硅烷化硅膠上,表明成功制得漆酚酯鍵合硅膠固定相。

表 1 硅膠、硅烷化硅膠和USP的元素分析結(jié)果

圖 4 (a)硅膠、(b)硅烷化硅膠和(c)USP的紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of (a) silica, (b) silanated silica, and (c) USP

2.2.2紅外光譜

硅烷化硅膠與漆酚酯鍵合硅膠固定相的紅外光譜見圖4。由圖4a可以明顯觀察到硅膠在3 490 cm-1處有明顯的吸收峰,該峰為Si-OH的伸縮振動峰,1 648 cm-1處的吸收峰為硅膠上結(jié)合水的H-O-H的彎曲振動峰,1 089 cm-1處的吸收峰為Si-O-Si的反對稱伸縮振動峰,972 cm-1處的吸收峰為Si-OH的彎曲振動峰,807 cm-1和458 cm-1處的吸收峰屬于Si-O的對稱伸縮振動。由圖4b可以觀察到:與硅膠相比,硅烷化硅膠在3 490 cm-1處的Si-OH伸縮振動峰明顯減弱,在972 cm-1處的Si-OH彎曲振動峰明顯消失,并在1 704 cm-1處和1 640 cm-1處出現(xiàn)了新的C=O吸收峰和C=C吸收峰,表明成功制備了硅烷化硅膠。由圖4c可以明顯觀察到鍵合硅膠固定相在3 490 cm-1處、1 704 cm-1處和1 640 cm-1處的吸收峰明顯增強,表明漆酚酯成功鍵合到硅烷化硅膠上。

2.2.3熱重分析

通過熱重分析評價漆酚酯鍵合硅膠固定相的鍵合量和熱穩(wěn)定性。分別稱取4 mg左右的待測物質(zhì)置于Al2O3坩堝內(nèi),溫度從35 ℃升至800 ℃且升溫速率為10 ℃/min,以N2作為保護氣,得到熱失重曲線(見圖5)?？捎^察到:硅膠(圖5a)、硅烷化硅膠(圖5b)和鍵合固定相(圖5c)在35～150 ℃出現(xiàn)較小的失重現(xiàn)象,失重率約為1%,這是由待測物質(zhì)脫水造成的;隨著溫度的升高,觀察到漆酚酯鍵合硅膠固定相出現(xiàn)明顯的熱失重現(xiàn)象,而硅烷化硅膠在300 ℃開始分解,硅膠在600 ℃開始分解,說明該段失重現(xiàn)象是由鍵合到硅烷化硅膠的漆酚酯熱分解造成的。在200～800 ℃范圍內(nèi)硅烷化硅膠和鍵合固定相的失重率分別為7%和12%,表明成功將漆酚酯鍵合到硅膠上,也證明了該固定相熱穩(wěn)定性良好。

圖 5 (a)硅膠、(b)硅烷化硅膠和(c)USP的熱失重曲線圖Fig. 5 Thermogravimetric (TG) curves of (a) silica, (b) silanated silica, and (c) USP

2.2.4固定相形貌表征

鍵合固定相的形貌表征如圖6。由圖6a和圖6b可以觀察到硅膠與漆酚酯鍵合硅膠固定相均具有良好的球形結(jié)構(gòu),粒徑在5 μm左右,分布均一,單分散性良好。與硅膠相比,漆酚酯鍵合硅膠固定相的表面變得粗糙,有明顯的附著物,說明漆酚酯成功鍵合到硅膠上。

2.3 色譜柱對中藥主要成分的分離

2.3.1對天麻主要成分的分離

以乙腈-0.05%磷酸溶液(3∶97, v/v)為流動相,柱溫25 ℃,進樣量20 μL,檢測波長220 nm,流速為0.4 mL/min,測試USP色譜柱對天麻浸膏的分離性能(天麻浸膏的制備參考《中國藥典》[22])。由圖7a可以看出,天麻浸膏經(jīng)USP柱分離后,出現(xiàn)5個色譜峰,其中一峰與天麻素對照品色譜峰保留時間一致。將流速調(diào)至1.0 mL/min,其他色譜條件不變,測試商品化C18柱對天麻浸膏的分離性能,結(jié)果如圖7b所示,經(jīng)商品化C18柱分離后出現(xiàn)4個色譜峰,其中一峰與天麻素對照品色譜峰保留時間一致。與商品化C18柱相比,USP柱對天麻浸膏的主要成分實現(xiàn)了基線分離,為天麻素的分離純化提供了新的思路。

圖 6 (a)硅膠和(b)USP的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron microscope images of (a) silica and (b) USP

圖 7 天麻浸膏在(a)USP柱和(b)C18柱上的色譜分離圖Fig. 7 Chromatographic separation of Gastrodia elata extract on (a) USP column and (b) C18 column

2.3.2對吳茱萸主要成分的分離

參考Sun等[15]的方法制備吳茱萸浸膏。

以乙腈-水(50∶50,v/v)為流動相,柱溫25 ℃,進樣量20 μL,檢測波長為290 nm,流速為0.5 mL/min,測試USP色譜柱對吳茱萸浸膏的分離性能。由圖8可以看出,浸膏經(jīng)USP色譜柱分離后,出現(xiàn)2個色譜峰,分別與吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品色譜峰的保留時間一致。而2020版《中國藥典》[22]用商品化C18柱分離的流動相為(乙腈-四氫呋喃(25∶15, v/v))-0.02%磷酸溶液(35∶65, v/v)。相對于商品化C18柱,USP柱的分離條件更加安全,簡單。

圖 8 吳茱萸浸膏在USP柱上的色譜分離圖Fig. 8 Chromatographic separation of Fructus evodiae extract on USP column

3 結(jié)論

本文以綠色可再生資源漆酚為原料制得UMA,將其均勻涂覆到硅烷化球形硅膠上,通過涂覆-自由基聚合成功制備了一種新型漆酚酯鍵合硅膠固定相。該固定相對天麻素表現(xiàn)出良好的分離性能,為分離純化天麻素及天麻的其他活性成分提供了新的途徑,有較好的應(yīng)用前景;同時,該固定相的成功制備為色譜固定相制備提供了新的思路,也擴展了生漆的應(yīng)用。關(guān)于USP色譜柱的性能評價和分離機理研究工作正在進行,后期會將USP填料做成制備柱,并用于天麻素和吳茱萸堿純化。