余曉琴,方科益,邵 曼,李澍才,陳小泉,*

(1.四川省食品藥品檢驗檢測院,四川成都 610000;2.寧波海關(guān)技術(shù)中心,浙江寧波 315000)

丁香酚類為苯丙素類化合物,可以從丁香樹、柴桂等多種植物中提取。主要包括丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙?；惗∠惴拥?具有麻醉[1-4]、抑菌[5]、抗氧化[6-7]等多種藥理作用。隨著人們生活水平的日益提高,對于水產(chǎn)品的需求,已經(jīng)不只停留在關(guān)注水產(chǎn)品的種類上,同時對水產(chǎn)品的質(zhì)量和鮮活度也提出了更高的要求。而丁香酚類化合物在漁用麻醉運輸方面較其他的麻醉劑具有成本低、效果好以及殘留期短的特點,近幾年各國都有將其應用于漁業(yè)生產(chǎn)與活鮮水產(chǎn)品流通運輸領域的報道[8-9]。丁香酚類化合物在我國作為允許使用的食品用合成香料(GB 2760,表B.3),執(zhí)行GB 1886.129-2015 食品安全國家標準,可應用于很多食品中,但鮮水產(chǎn)在(GB 2760表B.1)不得添加食品用香料、香精的食品名單中,表明鮮水產(chǎn)不得使用丁香酚。美國國家毒理學計劃(NTP)發(fā)布的毒理學數(shù)據(jù)顯示,丁香酚類化合物對嚙齒動物是致癌物或潛在的致癌物[1]。JECFA 規(guī)定丁香酚的ADI 為0～2.5 mg/kg bw[1]。

國內(nèi)目前沒有針對食品中丁香酚測定的國家或地方標準。查閱資料,有少量文獻及研究報道水產(chǎn)品中六種丁香酚類藥物的檢測方法[10-11],主要有高效液相色譜法(HPLC)[12-13]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[14-15]、氣相色譜法[16]及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-21]。本研究綜合目前文獻報道方法中試樣前處理方法開展預試驗時,發(fā)現(xiàn)回收率不夠理想甚至很低(部分方法回收率低至30%),逐步分析發(fā)現(xiàn)直接氮吹對目標化合物的回收率影響最大,采用氮吹濃縮時加入DMSO可降低其影響。為進一步摸底監(jiān)測水產(chǎn)品中丁香酚類化合物使用情況,有必要建立準確穩(wěn)定的檢測方法。本文以魚、蝦為研究基質(zhì),采用氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用測定六種丁香酚類化合物,并開展實際樣品測定,通過簡單點暴露評估分析可能的風險隱患。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品丁香酚(CAS No. 97-53-0)、甲基丁香酚(CAS No. 93-15-2)、異丁香酚(CAS No. 97-54-1)、順式-甲基異丁香酚(CAS No. 93-16-3)、乙酸丁香酚酯(CAS No. 93-28-7)、乙?；惗∠惴?CAS No. 93-29-8) 純度均≥98%,上海安譜科學儀器有限公司;樣品 在成都市多個農(nóng)貿(mào)市場隨機購買多種、多批次淡水魚、海水魚、淡水蝦、海水蝦,分別取魚腹部位魚肉和去殼后蝦肉均質(zhì)制樣;乙腈、正己烷、二甲亞砜(DMSO) 色譜純,美國Fisher公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電子轟擊電離源(EI)、50 mL tubes陶瓷均質(zhì)子 美國Agilent Technologies;T25 digital臺式均質(zhì)儀、MS3 digital渦旋振蕩器 美國IKA公司;IDH30超聲波清洗器 中國IRM公司;TurboVapLV氮吹儀 美國Biotage公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別準確稱取6種丁香酚類化合物標準品100 mg(精確到0.1 mg),用乙腈溶解,并定容至100 mL,此標準儲備溶液濃度約為1 mg/mL,4 ℃避光密封保存;將上述標準儲備溶液用乙腈稀釋制成0.01 mg/mL的混合標準中間溶液,4 ℃避光密封保存;用空白基質(zhì)溶液將混合標準中間溶液制成濃度為40、100、200、500、1000 μg/L的標準系列工作溶液,臨用時配制。

1.2.2 供試液制備 稱取試樣2 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入5 g無水硫酸鈉,適當攪拌混勻,加入一顆陶瓷均質(zhì)子和10 mL 乙腈,渦旋混勻1 min,超聲提取15 min,5000 r/min離心5 min,取上清液;殘渣中再加入10 mL乙腈重復提取一次,合并上清液;乙腈層中加入5 mL乙腈飽和的正己烷,渦旋振蕩1 min,5000 r/min離心5 min,棄去正己烷層;乙腈層加入50 μL的DMSO,40 ℃氮吹至近干,用乙腈定容至1 mL,混勻,用0.45 μm有機微孔濾膜過濾,供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.2.3 GC-MS分析 氣相色譜分離條件:DB-1701色譜柱(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度100 ℃,保持1 min,以6 ℃/min升溫至200 ℃,再以25 ℃/min升溫至260 ℃,保持5 min;進樣口溫度:230 ℃;載氣:氦氣(純度≥99.999%);流速1.0 mL/min;不分流進樣;進樣量1 μL[17-19]。

質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源(EI),正離子掃描、選擇離子監(jiān)控(SIM)模式;電離能量70 eV;傳輸線溫度260 ℃;離子源溫度:230 ℃;溶劑延遲時間:6.00 min;各化合物定量及定性離子見表1。

1.2.4 方法驗證 本研究在實驗室內(nèi)進行分析方法的驗證。在空白基質(zhì)提取液中添加系列混合標準工作液進GC-MS分析測定,以化合物的定量離子色譜峰面積為縱坐標,化合物添加濃度為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程。以信噪比(S/N)>3,采用空白基質(zhì)加標并逐級稀釋的方式確定方法的檢出限(LOD);通過方法精密度和回收率確定方法的定量限(LOQ)。基質(zhì)匹配標準曲線的范圍為20～1000 μg/L。方法的準確度和精密度通過測定加標回收率評價,加標水平為0.02、0.04和0.10 mg/kg,每個濃度水平重復測定6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用美國Agilent Technologies公司的MassHunter工作站用于控制儀器、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析,Microsoft Excel制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試液制備

2.1.1 提取溶劑選擇 本研究考察了6種丁香酚類化合物經(jīng)乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙醇分別提取后的回收率。結(jié)果(圖1)顯示:提取溶劑為乙酸乙酯時,回收率為40%～63%,提取效果較差;當提取溶劑為乙醇時,乙?；惗∠惴拥幕厥章实陀?0%;使用乙腈和甲醇提取時,6種丁香酚類化合物的提取效果較好,且乙腈較甲醇的提取效果更好,6種化合物的回收率均>75%,因此,最終確定乙腈作為樣品提取溶劑。

圖1 提取溶劑選擇(n=6)

2.1.2 凈化方式選擇 本研究考察了乙腈飽和正己烷脫脂、GCB凈化、QuEChERS凈化等方式,結(jié)果(圖2)顯示:用乙腈飽和的正己烷脫脂的凈化效果較好,6種化合物的回收率均大于80%;用GCB凈化,異丁香酚的回收率均僅為50%,其余組分的回收率均大于80%;用QuEChERS(安譜凈化包)凈化,異丁香酚的回收率僅為60%、甲基丁香酚和乙酸丁香酚酯的回收率不足70%。因此,確定使用乙腈飽和的正己烷脫脂作為凈化方式。

圖2 凈化方式選擇(n=6)

2.1.3 氮吹的影響與DMSO的使用 樣品經(jīng)乙腈提取后,提取液體積較大,且乙腈不適合作為氣相色譜的進樣溶劑,為了進一步提高方法靈敏度,并將溶劑置換成正己烷,同時考慮大量樣品同時操作的便利性,本研究中選擇氮吹進行乙腈提取溶液的濃縮。首先考察了6種丁香酚類化合物(10 μg/mL,n=3)在常見溫度40 ℃氮吹至干后的回收率,6種丁香酚類化合物的回收率為21.29%～63.27%(見表2)。6種丁香酚類化合物常溫下均為液態(tài),且沸點較低,結(jié)合實驗結(jié)果顯示,在常見40 ℃氮吹濃縮過程中,容易氣化,導致不同程度的損失。

表2 不同DMSO加入量對回收率的影響(n=6)

為提高丁香酚類化合物在氮吹過程中的保留率,考慮加入DMSO,以提高回收率。DMSO沸點較高,與乙腈、正己烷互溶,并對各種化合物具有良好的溶解性;通過在提取液中加入微量的DMSO,可使化合物在加熱氮吹過程中保留在DMSO中,減少氮吹過程中的氣化損失,有效提高待測物的回收率。本研究考察不同DMSO加入量對氮吹的影響,結(jié)果表明隨著加入量的增加,各組分回收率均有提高,當DMSO加入體積為50和100 μL時,回收率增加并不明顯,綜合考慮,氮吹前加入DMSO的量確定為50 μL。

2.2 色譜柱的選擇

本研究對比了DB-5(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm)及DB-1701(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm)兩種色譜柱對待測化合物的分離效果。如圖3所示,采用DB-5柱時,峰形存在拖尾,且異丁香酚及甲基異丁香酚在自然界存在同分異構(gòu)體,購置標準品中存在未純化完全同分異構(gòu)體,由于碎片離子接近,異丁香酚及甲基異丁香酚的同分異構(gòu)體雜質(zhì)會對甲基丁香酚和異丁香酚形成干擾,改變升溫程序也無法完全分離。而采用DB-1701時,峰形對稱,且可完全分離這兩種標準品雜質(zhì)峰。因此,選擇DB-1701作為色譜柱。

圖3 氣相色譜柱的選擇

2.3 基質(zhì)效應考察

本研究采用相對響應值法對四種水產(chǎn)品基質(zhì)的基質(zhì)效應進行了考察,即通過計算基質(zhì)標準曲線斜率和標準溶液曲線斜率之比,來評價基質(zhì)效應的程度。計算公式如下:

ME=(k2/k1)×100

式中:k1標準溶液曲線斜率;k2基質(zhì)標曲斜率。

一般來說,當ME 在80%～120% 之間時,表明基質(zhì)效應在可接受范圍內(nèi)。結(jié)果顯示四種基質(zhì)中6種化合物均存在不同程度的基質(zhì)效應(見表3),因此需采用基質(zhì)曲線進行定量。

表3 6種化合物在4種基質(zhì)中的基質(zhì)效應

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量限 在空白基質(zhì)提取液中添加系列混合標準工作液進 GC-MS分析測定,以化合物的定量離子色譜峰面積為縱坐標,化合物添加濃度為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程。6種丁香酚類化合物在20～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r均>0.999(表4)。采用空白基質(zhì)加標并逐級稀釋的方式進行檢出限確定,使檢出限濃度時對應的目標物信號信噪比(S/N)大于3,兼顧各儀器的靈敏度和精密度水平,最終在保證線性良好、相對標準偏差<15%、絕大部分化合物回收率60%～120%之間的前提下確定定量限。最終確定6種化合物在各基質(zhì)中的檢出限均為0.01 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg。

表4 6種丁香酚類化合物的標準曲線及相關(guān)系數(shù)

2.4.2 準確度與精密度 以淡水魚、淡水蝦、海水魚和海水蝦為基質(zhì),進行加標回收實驗。按照定量限的1倍、2倍、5倍進行3水平添加試驗,各濃度平行制樣6份。準確度以加標水平的回收率進行評價,以測出量對理論添加量的百分比值計算平均回收率和精密度。由表5可見,6種化合物各添加水平的平均回收率為64.8%～110.9%,相對標準偏差均<15%,方法的準確度和精密度均基本滿足定量分析的要求。

表5 6種丁香酚類化合物的回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.5 實際樣品測定

采用上述建立的方法,對從市場購買的121個樣本進行測定。共計35個樣本中檢出丁香酚類化合物,6種化合物中只有丁香酚被檢出,檢出率為28.9%(35/121),含量范圍為0.009～7 mg/kg,平均含量為0.6 mg/kg。其中海水魚檢出率較高,檢出率為58.5%(24/41),主要為石斑魚、鯧魚、多寶魚、海鱸魚、泥猛等品種。

2.6 暴露量評估

JECFA規(guī)定丁香酚的ADI 為0～2.5 mg/kg bw。結(jié)合本次檢測數(shù)據(jù)和中國居民膳食指南(2016年版)中建議水產(chǎn)類消費量(每天40～75 g,以75 g計算);以檢出率最高的海水魚做暴露評估,海水魚丁香酚檢測結(jié)果以及消費量開展點暴露量評估,24個樣本檢出丁香酚,最低值8.7 μg/kg,最大值2211 μg/kg,平均值226 μg/kg;按照殘留量最大值、平均值計算,每人(按成人體重60 kg計算)每天從海水魚中攝入的丁香酚總量占JECFA推薦ADI的0.01%和0.1%,結(jié)合考慮清洗、烹飪等因素,表明對人體產(chǎn)生的安全風險極低。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)合參考文獻報道方法,證實氮吹濃縮為回收率低的最大原因;針對這一問題優(yōu)化樣品前處理條件,在氮吹時加入50 μL DMSO,可減少氮吹過程中的氣化損失,有效提高6種丁香酚類化合物檢測的準確度和精密度,并且對分析系統(tǒng)不產(chǎn)生干擾;該方法操作簡便,定性定量準確,適用于水產(chǎn)品中6種丁香酚類化合物的同時檢測。通過對121個實際樣品測定后發(fā)現(xiàn),確實存在檢出丁香酚的情況,檢出率為28.9%,其中海水魚相對突出,丁香酚檢出率為58.5%;雖檢出率較高,但經(jīng)點暴露量評估,水產(chǎn)品中檢出的丁香酚對人體產(chǎn)生的安全風險極低。