馮小娜,齊 娜,宋 偉,劉 佳,劉立明,吳 靜,*

(1.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)是唯一一種能夠調(diào)控細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白功能狀態(tài)的磷脂,對(duì)細(xì)胞代謝過程有重要的調(diào)節(jié)作用[1-2],廣泛應(yīng)用于治療腦萎縮、兒童多動(dòng)癥、老年癡呆癥[3-4]、修復(fù)大腦損傷[5]、恢復(fù)腦疲勞、緩解抑郁[6-7]。由于自然界中天然PS含量稀少[8-9],且提取工藝繁雜,難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求,因此,開發(fā)環(huán)境友好、安全性高的磷脂酰絲氨酸生產(chǎn)方法,對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大磷脂酰絲氨酸應(yīng)用范圍、改善人民身體健康具有重要意義。

PS的制備方法分為提取法和生物酶法[10-11]。提取法是以動(dòng)物肝臟、腦或大豆等植物種子為原料,通過使用大量有機(jī)溶劑萃取制得,成本昂貴且工藝復(fù)雜,難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[12]。生物酶法以磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)和L-絲氨酸(L-serine)作為反應(yīng)底物,在磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)或磷脂酰絲氨酸合酶(Phosphatidylserine synthase,PSS)的催化作用下,發(fā)生轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)生成PS[13]。這一技術(shù)路線具有反應(yīng)條件溫和、操作步驟簡單、環(huán)境污染小、產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點(diǎn)[14]。

磷脂酶(Phospholipase D,EC 3.1.4.4,PLD)廣泛分布于動(dòng)物肝臟、植物根葉和微生物中[15]。PLD既能發(fā)生水解反應(yīng),水解磷脂生成磷脂酸,也能發(fā)生轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng),催化羥基化合物(L-serine、甘油、乙醇胺、肌醇)結(jié)合到磷脂?；?形成新的磷脂[16]。其中轉(zhuǎn)磷脂酰作用更加重要,可以合成稀有磷脂如PS等[17]。然而,野生型PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；钚暂^低,造成產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率不高,難以滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求。對(duì)酶分子進(jìn)行蛋白質(zhì)功能改造能有效提高催化活性、擴(kuò)大底物范圍和改善酶穩(wěn)定性[18],但有關(guān)蛋白質(zhì)工程改造PLD提高PS產(chǎn)量的研究較少。Ogino等[19]證明輪枝鏈霉菌PLD中的保守甘氨酸-甘氨酸(GG)和甘氨酸-絲氨酸(GS)基序,特別是絲氨酸殘基對(duì)轉(zhuǎn)磷脂?；钚灾陵P(guān)重要,突變體G215S、G216S和G216S/S489G的轉(zhuǎn)磷脂?；钚栽鰪?qiáng)9～27倍。

針對(duì)這一現(xiàn)狀,本文將不同來源磷脂酶D在大腸桿菌中在進(jìn)行異源表達(dá),篩選出最佳來源的PLD并進(jìn)行同源建模,基于結(jié)構(gòu)分析催化通道及活性口袋,對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造,從而獲得磷脂酰絲氨酸(PS)產(chǎn)量提高的突變體,進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)量提高的機(jī)制進(jìn)行闡釋,并將最佳突變體在3 L規(guī)模轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶D目的基因來源菌株:StreptomycesghanaensisCGMCC 4.1967、StreptomyceskatraeCGMCC 4.1914、StreptomycesmobaraensisCGMCC 4.1719、AcinetobacterradioresistensCGMCC 1.15256、AcinetobactervenetianusACCC 19918、ThalassomonasactiniarumCGMCC 1.12876、StreptomycesgriseofuscusACCC 41181 購買自中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC/中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC;E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)、載體pET-28a質(zhì)粒 均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏;Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker、Solution I、DpnI Takara公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)股份公司;SanPrep柱式PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素 生工生物工程(上海)股份有限公司;標(biāo)品磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸 美國Sigma-Aldrich公司;胰蛋白胨、酵母粉 英國OXIOD公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純,購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZQZY-CS9搖床 上海知楚儀器公司;VS-1300L超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;164-5050核酸電泳儀 美國Bio·Rad公司;320-S型臺(tái)式精密pH計(jì) 瑞士METTLER公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SpetraMax M3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PLD的異源表達(dá)及重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 提取7種不同來源菌株(Streptomycesghanaensi、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensi、Acinetobacterradioresistens、Acinetobactervenetianus、Thalassomonasactiniarum、Streptomycesgriseofuscus)的基因組DNA,以其為模板,利用PCR擴(kuò)增得到PLD的目的基因。將以上片段與T載連接并導(dǎo)入E.coliJM109(DE3)中,提取質(zhì)粒后與pET-28a(+)的質(zhì)粒均進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物連接后導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)中。

將以上7種大腸桿菌重組菌株接種于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,按照2%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接于100 mL含卡那霉素抗性的TB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí),添加IPTG至其終濃度為1.0 mmol/L,25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。4 ℃、6000 r/min條件下離心獲得的菌體即為全細(xì)胞催化劑,按照1.2.2和1.2.8方法測定7種重組菌株對(duì)底物磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化能力及酶活。

1.2.2 兩相體系轉(zhuǎn)化PC和L-serine 以野生型PLD作為全細(xì)胞催化劑,使用雙相體系制備PS。有機(jī)相使用綠色溶劑環(huán)戊基甲醚、水相、有機(jī)相的體積比為1∶3、L-serine和PC的底物摩爾比為5∶1,其中底物PC的添加量為76 g·L-1，反應(yīng)溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為4 h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到的磷脂產(chǎn)品利用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測,具體見方法1.2.9。

1.2.3 磷脂酶D的同源建模及分子對(duì)接 利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站(https://swissmodel. expasy. org/)搜索與Streptomyceskatrae菌株磷脂酶D的蛋白序列一致性較高的蛋白晶體結(jié)構(gòu),運(yùn)用MODELLER9.11(http://salilab.org/modeller)程序?qū)υ摰鞍拙w進(jìn)行同源建模,并采用蛋白分子可視化軟件PyMol(http://pymol.org)對(duì)模擬的磷脂酶D蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

使用ChemSpider在線網(wǎng)站(http://www. chemspider. com/)下載配體PC、L-serine和H2O的3D結(jié)構(gòu),并利用分子對(duì)接軟件Auto Dock進(jìn)行剛性對(duì)接。將配體L-serine和PC對(duì)接入復(fù)合物PLD-PC、PLD-L-serine,獲得PLD-PC-L-serine、PLD-L-serine-PC兩種對(duì)接結(jié)果,將配體H2O對(duì)接入復(fù)合物PLD-L-serine獲得第三種對(duì)接結(jié)果PLD-L-serine-H2O。

1.2.4 PLD催化通道及催化腔體積模擬分析 利用Caver Analyst軟件對(duì)SkPLD的催化通道進(jìn)行模擬分析[20],軟件參數(shù)設(shè)置為probe_radius 0.7、shell_depth 4.0、shell_radius 6.0;計(jì)算催化腔體積的參數(shù)設(shè)置為Pockets Large probe 4.0、Residues included His 192、His492。

1.2.5 突變體菌株的構(gòu)建 將位點(diǎn)Asp214、Thr362、Gly398、Val400、Ser402、Tyr405突變成Ala、位點(diǎn)Asn209、Asp224、Gln357、Asp370、Gln405、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481依次突變成Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met。以重組質(zhì)粒pET28a-SkPLD為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。反應(yīng)體系包括PrimerStar酶0.5 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、10×PS buffer 10 μL、dNTP 4 μL、DMSO 5 μL,加水至終體積50 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min 40 s(29個(gè)循環(huán));72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含卡那霉素的LB平板上。挑取陽性克隆子送至測序,測序正確的即為構(gòu)建的突變體菌株。

1.2.6 突變體的動(dòng)力學(xué)研究 按照1.2.2的最佳轉(zhuǎn)化條件,將磷脂酶D與底物磷脂酰膽堿(PC)反應(yīng),測定PLD酶活,根據(jù)米氏方程,使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法,計(jì)算出磷脂酶D的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.7 規(guī)?；苽銹S 將磷脂酰絲氨酸的制備規(guī)模放大到3 L的發(fā)酵罐上進(jìn)行,轉(zhuǎn)化體系設(shè)置為:76 g·L-1的PC、30 g·L-1的濕菌體。控制條件為:pH5.5、溫度25 ℃、通氣1 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.2.8 酶活測定方法 磷脂酶D的酶活性測定參見文獻(xiàn),并略作修改[21]。取13.5 μL的10 mmol/L的卵磷脂底物溶液和3.5 μL的100 mmol/L CaCl2溶液,用HCl調(diào)節(jié)pH至8.0,加入10 mL酶溶液,于50 ℃反應(yīng)10 min。100 ℃反應(yīng)1 min后,立即加入1 U膽堿氧化酶、1 U辣根過氧化物酶、70 μL顯色液(0.24 mg/mL 4-氨基安替比林、0.16 mg/mL苯酚溶于100 mmol/L Tris-HCl),于37 ℃下反應(yīng)10 min。在500 nm下檢測反應(yīng)液的吸光度。

酶活力定義為:以卵磷脂為底物,37 ℃條件下,每分鐘產(chǎn)生1 μmol膽堿所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位,記為U/mL。

1.2.9 HPLC法檢測磷脂 HPLC色譜條件:色譜柱為LiChrospher? 100 DIOL(5 μm,250 mm×4 mm),以正己烷∶異丙醇∶乙酸-乙酸鈉(8∶8∶1,v/v/v)為流動(dòng)相,樣品用0.22 μm膜過濾,柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為210 nm,進(jìn)樣量為20 μL,流速為1 mL/min,利用色譜圖中峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中磷脂酰膽堿PC、磷脂酰絲氨酸PS和磷脂酸PA的轉(zhuǎn)化率[22]。轉(zhuǎn)化率計(jì)算如下:

式中:mPS/PA表示PS、PA的質(zhì)量,g;mPC表示PC的初始質(zhì)量,g;742、398和758分別表示PS、PA和PC的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。利用Original 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖分析。利用可視化軟件PyMol對(duì)模擬的磷脂酶D蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 親本酶及反應(yīng)瓶頸

首先以Streptomycessp. PMF的PLD序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì),選擇相似性在30%～70%的7種來源不同的PLD,將其異源表達(dá)于E.coliBL21(DE3)中,具體見方法1.2.1。將7種重組菌株以磷脂酰膽堿(PC)和L-serine為底物,篩選到4種具有轉(zhuǎn)磷脂?；钚缘腜LD,分別是來源于Streptomycesghanaensis、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensis、Acinetobacterradioresistens,結(jié)果列于表1。其中Streptomyceskatrae來源的PLD酶活為18.6 U/mL、轉(zhuǎn)化率為31.3%。因此,后續(xù)研究中選擇Streptomyceskatrae的PLD作為親本酶用于蛋白質(zhì)改造。

表1 不同來源PLD的酶活性和轉(zhuǎn)化率

為了確定提高PLD催化效率的限制因素,按照1.2.2的轉(zhuǎn)化條件,以野生型SkPLD作為全細(xì)胞催化劑,使用雙相體系制備PS。野生型SkPLD轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為34.8%,PS產(chǎn)量為26.5 g·L-1;水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為31.2%,生成大量的副產(chǎn)物磷脂酸(PA),且仍有33.9%的底物PC未反應(yīng)。因此,確定磷脂酶D的反應(yīng)瓶頸主要包括兩個(gè)方面:轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)的催化效率低(<35%);水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率過高(>30%),形成大量副產(chǎn)物PA。

2.2 磷脂酶D的蛋白質(zhì)改造

2.2.1 磷脂酶D的同源建模及分子對(duì)接 為了更準(zhǔn)確地識(shí)別影響PLD結(jié)合大體積磷脂底物的關(guān)鍵殘基,利用Swiss-Model在線軟件,選擇與SkPLD蛋白序列相似性為53%的來源于Streptomycessp. PMF的磷脂酶D蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào):1F01)進(jìn)行同源建模,野生型磷脂酶D結(jié)構(gòu)如圖1a?！癏xKxxxxD(HKD)”結(jié)構(gòu)域是PLD超家族的結(jié)構(gòu)特征,以單拷貝或雙拷貝的形式存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)中,且HKD結(jié)構(gòu)域中的組氨酸殘基在催化中發(fā)揮重要作用。SkPLD具有兩個(gè)HKD結(jié)構(gòu)域,關(guān)鍵催化殘基為192位His和462位His。

圖1 SkPLD的同源建模及分子對(duì)接

研究表明雙底物(PC和L-serine)和PLD的結(jié)合順序?qū)τ跇?gòu)建準(zhǔn)確的反應(yīng)模型有重要作用[23],其中PC與PLD-Ser的相互作用是唯一的結(jié)合途徑。將底物PC對(duì)接入PLD-Ser復(fù)合物的活性口袋中,如圖1b所示,底物磷脂酰膽堿的兩條長脂肪酸鏈暴露在蛋白表面,這一結(jié)果表明,由于底物通道狹小或存在位阻效應(yīng),導(dǎo)致底物結(jié)合腔無法完全容納體積較大的磷脂底物PC。

磷脂酶D催化合成PS的機(jī)理是[24]:His192作為親核試劑攻擊底物PC的磷原子,形成帶負(fù)電荷的五價(jià)磷過渡態(tài);然后,His462釋放一個(gè)質(zhì)子,提供氫以產(chǎn)生膽堿和磷脂?；?酶中間體;接著,第二底物L(fēng)-serine進(jìn)行去質(zhì)子化(脫去氫),活化的L-serine作為攻擊磷脂?；?酶中間體中磷原子的第二親核體,從而產(chǎn)生磷脂酰絲氨酸(PS)。根據(jù)催化機(jī)理分析比較His462與底物L(fēng)-serine和H2O的催化距離,如圖1c所示,His462 N原子與L-serine O原子的催化距離d1為5.8 ?、His462 N原子與H2O O原子的催化距離d2為4.1 ?,d1>d2,且相較于L-serine,PLD與H2O的結(jié)合能(-5.19 kcal/mol)更高,說明PLD更易與水分子結(jié)合,從而發(fā)生水解反應(yīng)。

因此,如要提高SkPLD的催化效率,需要從兩個(gè)方向?qū)LD進(jìn)行改造:擴(kuò)大底物催化通道,降低底物進(jìn)入口袋的位阻效應(yīng),使其能夠容納大體積底物PC,提高PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；钚?提高PLD活性位點(diǎn)His462與L-serine的親和力,降低水解反應(yīng)。

2.2.2 磷脂酶D的蛋白質(zhì)改造 按照方法1.2.4利用Caver Analyst軟件對(duì)SkPLD的催化通道進(jìn)行模擬分析,發(fā)現(xiàn)SkPLD有3個(gè)催化通道,分別為Tun_a、Tun_b、Tun_c,如圖2a～c所示,其中Tun_a的通道長度為13.55 ?,無瓶頸半徑及瓶頸氨基酸殘基;Tun_b的通道長度為18.96 ?,瓶頸半徑為2.03 ?,瓶頸氨基酸殘基是Thr362、Gly398、Val400;Tun_c的通道長度為16.56 ?,瓶頸半徑為1.83 ?,瓶頸氨基酸殘基是Asp214、Ser402、Tyr405。因?yàn)槠款i半徑大小會(huì)直接影響底物分子進(jìn)入活性腔的難易程度,半徑越大,底物分子越容易進(jìn)入活性腔[25]。因此通過引入小體積氨基酸Ala來擴(kuò)大瓶頸半徑,共構(gòu)建6個(gè)單突變體(T362A、G398A、V400A、D214A、S402A、Y405A)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)單突變體SkPLDY405A的突變效果最佳,轉(zhuǎn)化率達(dá)到47.2%,PS產(chǎn)量為35.9 g·L-1。

由于底物PC的磷脂頭部為親水性,而尾部的長脂肪酸鏈為疏水性,磷脂酶D結(jié)合區(qū)域的親疏水性會(huì)對(duì)底物進(jìn)入活性口袋造成位阻效應(yīng)。利用LigPlot+軟件分析底物PC在酶催化口袋的氫鍵相互作用及疏水作用,如圖2d所示,發(fā)現(xiàn)配體PC的脂肪酸鏈與Asn209、Asp224、Gln357、Gln405、Asn479、Tyr481發(fā)生氫鍵相互作用。通過引入疏水性氨基酸(Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met),構(gòu)建了42個(gè)單突變體,其中單突變體SkPLDQ407G轉(zhuǎn)化效果最佳,其轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.1%,PS產(chǎn)量為34.3 g·L-1。

圖2 SkPLD的催化通道及配體PC周圍的相互作用

為了提高PLD與L-serine的結(jié)合程度,將配體H2O對(duì)接入磷脂酶D的活性口袋,選擇5 ?范圍內(nèi)的5個(gè)極性氨基酸殘基(Asp370、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481),通過引入疏水性氨基酸來降低PLD與H2O的氫鍵相互作用,構(gòu)建35個(gè)單突變體。其中獲得兩個(gè)有益單突變體SkPLDD370P和SkPLDK478P,PS轉(zhuǎn)化率分別為41.7%、42.2%,PS產(chǎn)量分別為31.7、32.1 g·L-1。對(duì)其進(jìn)行組合突變后構(gòu)建雙突變體SkPLDD370P/K478P,其PS轉(zhuǎn)化率提高到50.8%,PS產(chǎn)量為38.6 g·L-1。

表2 WT及各突變體的PS、PA產(chǎn)量及PC殘留量

將Y405A、Q407G、D370P、K478P四個(gè)有益突變位點(diǎn)進(jìn)行組合突變,獲得最佳四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,其PS轉(zhuǎn)化率達(dá)到55.6%,PS產(chǎn)量42.3 g·L-1,分別比WT提高59.8%、59.6%。測定WT與突變體SkPLDY405A、SkPLDQ407G、SkPLDD370P、SkPLDK478P、SkPLDD370P/K478P、SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PA生成量及PC殘留量,WT的PC殘留量為25.8 g·L-1、PA生成量為23.7 g·L-1,四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PC殘留量為15.4 g·L-1,相較于WT降低40.3%,副產(chǎn)物PA生成量為18.3 g·L-1,相較于WT降低22.8%。

2.3 突變體評(píng)價(jià)及機(jī)理解析

以磷脂酰膽堿為底物測定磷脂酶D野生型及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表3。野生型SkPLD和四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的Km值分別為12.36和10.95 mmol/L,kcat分別為9.76和16.75 s-1。四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的kcat/Km[1.53(mmol/L)-1s-1]比WT[0.79(mmol/L)-1s-1]提高93.7%,總轉(zhuǎn)換數(shù)(TTN)(20100)是WT(12000)的1.68倍。

表3 WT及突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

為了解析催化效率提高的原因,利用CAVER Analyst對(duì)最佳四突變體的催化腔體積進(jìn)行測定。如圖3a所示,WT催化腔體積為546.6 ?3,四突變體SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P的催化腔體積擴(kuò)大到718.6 ?3,這一結(jié)果表明將位于底物通道的Y405、Q407突變成小體積的氨基酸Ala、Gly能顯著擴(kuò)大磷脂酶D催化口袋,從而提高PLD對(duì)大體積底物PC的催化活性。另一方面,四突變體SkPLDD370PY405A/Q407G/K478PHis462 N原子與L-serine O原子之間的距離(d1)比WT縮短了0.6 ?,與H2O的O原子之間的距離(d2)增加了0.8 ?,如圖3c所示。此外,相較于WT,SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P與H2O的結(jié)合能減小到5.02 kcal/mol、與L-serine的結(jié)合能提高到-4.76 kcal/mol,說明位于活性位點(diǎn)His462附近的D370、K478突變成疏水性氨基酸Pro能夠提高PLD與L-sreine的結(jié)合力。

圖3 D370P、Y405A、Q407G、K478P的空間分布及催化腔變化

2.4 制備級(jí)規(guī)模轉(zhuǎn)化

在最佳的轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件下,將制備PS的規(guī)模放大到3 L體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化。以SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P作為全細(xì)胞催化劑,反應(yīng)4 h后,PS產(chǎn)量為50.4 g·L-1,轉(zhuǎn)化率達(dá)到66.3%,時(shí)空產(chǎn)率為12.6 g/L/h,為工業(yè)化生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸奠定了基礎(chǔ)。

圖4 3L發(fā)酵罐上SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P發(fā)酵產(chǎn)PS的過程曲線

3 結(jié)論

本研究將來源于Streptomyceskatrae的PLD過量表達(dá)于E.coli中并構(gòu)建了高效催化合成PS的菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-SkPLD,限制其轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PS產(chǎn)量進(jìn)一步提高的瓶頸在于:較低的轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)的催化效率和較高的水解反應(yīng)速率。在對(duì)SkPLD蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳盡解析后借助理性蛋白質(zhì)工程策略擴(kuò)大PLD底物催化通道,降低大體積底物PC進(jìn)入底物口袋的位阻效應(yīng),提高PLD轉(zhuǎn)磷脂?；钚?同時(shí)通過提高活性位點(diǎn)His462與L-serine的親和力,降低水解反應(yīng)速率,獲得4個(gè)有益突變體(Y405A、Q407G、D370P、K478P),組合突變后獲得的最佳四突變體SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的轉(zhuǎn)化率達(dá)到55.6%、PS產(chǎn)量為42.3 g·L-1、kcat/Km為1.53 (mmol/L)-1s-1,分別比WT提高59.8%、59.6%、93.7%。轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量進(jìn)一步提高的原因在于,突變體催化腔體積增加到718.6 ?3,且活性位點(diǎn)與L-serine催化距離縮短0.6 ?、與競爭底物H2O的催化距離增加0.8 ?。在3 L規(guī)模轉(zhuǎn)化體系中,最佳突變體的PS產(chǎn)量為50.4 g·L-1、轉(zhuǎn)化率達(dá)到66.3%,時(shí)空產(chǎn)率為12.6 g/L/h。