裴晉紅，宋英達(dá)，武翠玲

(長治醫(yī)學(xué)院，山西 長治， 046000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科、芍藥屬植物，是原產(chǎn)我國的傳統(tǒng)名花與藥用植物，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]。1960～1970年人們發(fā)現(xiàn)牡丹籽中含有“油”，開始利用牡丹籽進(jìn)行粉碎榨油，2011年，我國衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品，油用牡丹種植及開發(fā)利用獲得迅猛發(fā)展。油用牡丹籽提取油后剩余大量餅粕，含有大量的生物活性物質(zhì)[2-5]。目前對(duì)牡丹籽粕的研究較少，主要轉(zhuǎn)化為飼料后用于養(yǎng)殖，附加值較低，造成較大的浪費(fèi)。

多糖是一類重要的天然生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]、增強(qiáng)免疫[9-10]、降血脂、降血糖[11-12]、抑菌[13]等生物學(xué)功能，在臨床上被用于治療多種疾病[14]。牡丹中含有大量的多糖，目前研究較多的是牡丹丹皮多糖[15]、牡丹籽果莢多糖[16]、牡丹雄蕊多糖[17]和牡丹葉片多糖[18]等，鮮見有牡丹籽粕多糖(peony seed dreg polysaccharides,PSDP)的系統(tǒng)研究[19]。研究主要集中在分離提取方法探索與工藝優(yōu)化，較少研究者進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、清除自由基等研究。

硒化多糖通過化學(xué)修飾方法將多糖與無機(jī)硒結(jié)合成有機(jī)硒化合物[20]，使硒和多糖的生理活性和藥理功能得到優(yōu)化，增強(qiáng)多糖的抗氧化活性[21]。人工合成的硒化多糖有硒化米胚多糖[22]、梭柄松苞菇富硒多糖[23]和蓮藕多糖[24]等，對(duì)于硒化牡丹籽粕多糖(selenium-containing peony seed dreg polysaccharides，Se-PSDP)及其抗氧化的研究還鮮有報(bào)道。

利用水提醇沉法從牡丹籽粕中提取粗多糖PSDP，之后經(jīng)離子交換層析制得牡丹籽粕多糖PSDPⅠ、PSDPⅡ及PSDP Ⅲ，對(duì)PSDP Ⅲ進(jìn)行硒化修飾后獲得具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphengl-2-picrylhydrqzy,DPPH)自由基清除能力、·OH清除能力和DNA氧化損傷抑制活性的Se-PSDP Ⅲ。通過建立H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷模型，從細(xì)胞水平研究Se-PSDP Ⅲ可能的抗氧化作用，為Se-PSDP的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為牡丹籽粕的綜合高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

牡丹籽粕,山西智華牡丹生物科技公司；巨噬細(xì)胞系RAW 264.7,中科院上海生命科學(xué)院；超氧化物岐化酶(superoxide,SOD)檢測(cè)試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxide,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所；鄰菲羅啉,索萊寶生物科技有限公司；FeSO4、H2O2、亞硒酸鈉,上海生物工程有限公司。

Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；AKATA Pure 25蛋白純化系統(tǒng)，美國GE公司；Sunrise-Basic酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；DMI3000B倒置熒光顯微鏡，德國LEICA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽粕多糖的制備及硒化修飾

經(jīng)超臨界萃取油脂后得到的牡丹籽粕，經(jīng)熱水浸提、Sevag法脫蛋白[25]、透析、乙醇沉淀和冷凍干燥后得到牡丹籽粕粗多糖。采用DEAE-Sepharose FF離子交換層析對(duì)粗多糖進(jìn)行分級(jí)：首先用雙蒸水平衡層析柱，按照質(zhì)量濃度1.0 mg/mL進(jìn)行上樣，分別采用雙蒸水、0.2 mol/L NaCl、0.4 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，H2SO4-苯酚法檢測(cè)多糖含量，將收集的多糖溶液透析，冷凍干燥。采用HNO3-亞硒酸鈉法[26]，按照多糖-亞硒酸鈉質(zhì)量比5∶4在70 ℃下反應(yīng)10 h，制得Se-PSDP多糖，紫外分光光度法檢測(cè)硒含量。

1.2.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用質(zhì)量濃度2.5 g/L胰酶消化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Se-PSDP Ⅲ對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

將RAW264.7的細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含Se-PSDP Ⅲ、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。Se-PSDP Ⅲ的終質(zhì)量濃度分別為0、100、200、300、400和500 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后加入CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于450 nm波長處檢測(cè)吸光度，細(xì)胞存活率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷模型的建立

將RAW264.7的細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含H2O2、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。H2O2的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3和0.4 mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后加入CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于450 nm波長處檢測(cè)吸光度，細(xì)胞存活率計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

1.2.5 DPPH自由基清除率檢測(cè)[27]

分別取20 μL質(zhì)量濃度為0.5、1.0和4.0 mg/mL的多糖樣品，加入60 μmol/L的DPPH溶液 (以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為溶劑) 100 μL，在室溫下密封避光反應(yīng)60 min，然后檢測(cè)517 nm波長處的吸光度，清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中:As,實(shí)驗(yàn)組吸光度;Ab,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替DPPH后的吸光度；Ac，用雙蒸水代替樣品后的吸光度；每組做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以質(zhì)量濃度200 μg/mL VC作為陽性對(duì)照。

1.2.6 ·OH清除率檢測(cè)

取40 μL濃度為2 mmol/L的FeSO4，加入40 μL濃度為2 mmol/L的鄰菲羅啉及80 μL多糖樣品后，加入40 μL體積分?jǐn)?shù)0.03%的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃孵育60 min，于536 nm波長處檢測(cè)吸光度，清除率計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中:As,實(shí)驗(yàn)組吸光度;An,用雙蒸水代替多糖后的吸光度;Ab,用雙蒸水代替H2O2后的吸光度;每組做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 DNA氧化損傷抑制實(shí)驗(yàn)

取8 μL PUC18質(zhì)粒DNA，加入2 μL 2 mmol/L FeSO4與8 μL待測(cè)組分，輕輕混勻后，加入2 μL 0.1 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴10 min，質(zhì)量濃度10 g/L瓊脂糖凝電泳分析，以雙蒸水代替樣品作為損傷組。

1.2.8 RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的檢測(cè)

將RAW264.7巨噬細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)液同步化饑餓培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、H2O2組(0.2 mmol/L H2O2)和H2O2+Se-PSDP Ⅲ組(0.2 mmol/L H2O2+100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ)，分別培養(yǎng)24 h。用無血清培養(yǎng)基按體積比1∶1 000稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，之后每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37 ℃避光孵育40 min后，用磷酸鹽緩沖液(phospate buffer saline,PBS)洗滌細(xì)胞3次。將6孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞光鏡下及熒光激發(fā)狀態(tài)下的形態(tài)。

1.2.9 Se-PSDP Ⅲ對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力的調(diào)節(jié)

將RAW264.7巨噬細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)液同步化饑餓培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、H2O2組(0.2 mmol/L H2O2)、H2O2+ Se-PSDP Ⅲ組(0.2 mmol/L H2O2+100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ)組，分別培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書對(duì)SOD及GSH-Px活力進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽粕多糖的制備與硒化修飾

利用DEAE-Sepharose FF離子交換層析對(duì)牡丹籽粕粗多糖進(jìn)行分級(jí)，分別采用雙蒸水、0.2 mol/L NaCl和0.4 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，獲得牡丹籽粕多糖PSDPⅠ、PSDPⅡ和PSDP Ⅲ，得率分別為4.1%、3.6%和31%。其中PSDP Ⅲ得率最高(圖1-a)，且Se-PSDP Ⅲ較PSDP Ⅲ表現(xiàn)出更強(qiáng)的DPPH清除能力(圖1-b)。后續(xù)以Se-PSDP Ⅲ為研究對(duì)象并測(cè)得其硒含量為1.1 mg/g。

2.2 Se-PSDP Ⅲ及H2O2對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

由圖2-a可知，與空白組相比，質(zhì)量濃度100、200、300、400和500 μg/mL的Se-PSDP Ⅲ對(duì)巨噬細(xì)胞存活率無明顯影響，說明該濃度可以用于后續(xù)的ROS實(shí)驗(yàn)。由圖2-b可知，0.1、0.2 mmol/L的H2O2對(duì)巨噬細(xì)胞存活率影響較小，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇濃度為0.2 mmol/L的H2O2建立氧化損傷細(xì)胞模型。

a-DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜圖; b-Se-PSDP Ⅲ與PSDP的DPPH清除率比較圖1 PSDPⅢ陰離子交換色譜圖和Se-PSDP Ⅲ與PSDPⅢ的DPPH清除率比較圖Fig.1 Elution profile of PSDP Ⅲ on DEAE-Sepharose FF chromatography and comparison of DPPH scavenging activity between Se-PSDP Ⅲ and PSDP Ⅲ注：*表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

a-Se-PSDP Ⅲ; b-H2O2圖2 Se-PSDP Ⅲ和H2O2對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.2 Relative cell viability of RAW264.7 induced by Se-PSDP Ⅲ and H2O2

2.3 DPPH自由基和·OH清除能力

如圖3-a所示，Se-PSDP Ⅲ對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，且4 mg/mL的Se-PSDP Ⅲ與200 μg/mL的VC作用相當(dāng)，對(duì)DPPH的清除率可達(dá)到80%左右。由圖3-b可知，Se-PSDP Ⅲ表現(xiàn)出較強(qiáng)的·OH清除能力，并且具有一定的濃度依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，Se-PSDP Ⅲ的·OH清除率為93.7%。

a-DPPH自由基清除率; b-·OH清除率圖3 Se-PSDP Ⅲ的DPPH自由基和·OH清除率Fig.3 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities of Se-PSDP Ⅲ

2.4 Se-PSDP Ⅲ對(duì)DNA氧化損傷的抑制作用

如圖4所示，泳道2為無損傷組，質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)完好，超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA(supercoiled DNA, scDNA)含量最高。泳道3為損傷組，DNA氧化損傷嚴(yán)重，scDNA基本消失，質(zhì)粒DNA被損傷成為線性結(jié)構(gòu)(linear DNA,lDNA)。泳道1為Se-PSDP Ⅲ保護(hù)組，在lDNA下方出現(xiàn)了少量的scDNA，這表明DNA氧化損傷程度有所降低，說明Se-PSDP Ⅲ具有一定的抑制DNA氧化損傷的能力。

1-H2O2+ FeSO4+ Se-PSDP Ⅲ；2-PUC18；泳道3 H2O2+ FeSO4圖4 Se-PSDP Ⅲ抑制DNA氧化損傷的能力Fig.4 Protective effect of Se-PSDP Ⅲ on oxidation-induced DNA damage

2.5 Se-PSDP Ⅲ對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

活性氧是指化學(xué)性質(zhì)活潑的具有含氧基團(tuán)的化合物。ROS過度增加或持續(xù)存在可對(duì)細(xì)胞形成氧化應(yīng)激，造成多種損傷。H2O2是研究ROS的重要工具，H2O2可迅速穿過細(xì)胞膜，通過Fention反應(yīng)，生成·OH，·OH激發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，可用于模擬ROS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的氧化損傷。如圖5所示，0.2 mmol/L H2O2處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞相較對(duì)照組細(xì)胞具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。0.2 mmol/L H2O2和100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ處理組的細(xì)胞與對(duì)照組基本一樣，細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到熒光。該結(jié)果表明Se-PSDP Ⅲ可以有效降低RAW264.7巨噬細(xì)胞中的ROS水平。

圖5 DCFH-DA探針法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧(×100)Fig.5 Intracellular ROS in RAW264.7 macrophages indicated as green fluorescence by DCFH-DA

2.6 Se-PSDP Ⅲ對(duì)H2O2介導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力影響

細(xì)胞內(nèi)存在完善的抗氧化防御體系，能夠直接清除自由基，使自由基處于動(dòng)態(tài)平衡。如SOD、GSH-Px等。Se-PSDP Ⅲ對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響如圖6所示。

a-SOD的相對(duì)酶活力; b-GSH-Px的相對(duì)酶活力圖6 Se-PSDP Ⅲ對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活力的影響Fig.6 Effect of Se-PSDP Ⅲ on SOD and GSH-Px activities in RAW264.7 stimulated by H2O2

與對(duì)照組相比，H2O2處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力都有所下降，而質(zhì)量濃度100 μg/mL的Se-PSDP Ⅲ可使胞內(nèi)SOD相對(duì)活力從82.6%升高到97.5%，GSH-Px相對(duì)活力從95.3%升高到113.3%，差異具有顯著性。該結(jié)果表明Se-PSDP Ⅲ對(duì)H2O2介導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性具有正向調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論與討論

牡丹籽粕粗多糖經(jīng)陰離子交換柱層析后制得PSDPⅠ、PSDPⅡ和PSDP Ⅲ，其中PSDP Ⅲ得率較高，PSDP Ⅲ經(jīng)硒化修飾后抗氧化活性得到一定程度的提高，且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好，所以將牡丹籽粕硒化多糖Se-PSDP Ⅲ作為后續(xù)研究對(duì)象。牡丹籽粕硒化多糖Se-PSDP Ⅲ具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力及DNA氧化損傷抑制能力。Se-PSDP Ⅲ可以降低氧化損傷后巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，提高胞內(nèi)SOD與GSH-Px的活性。細(xì)胞內(nèi)ROS的水平及SOD與GSH-Px的活性是評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的關(guān)鍵指標(biāo)，表明Se-PSDP Ⅲ可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)，對(duì)H2O2引起的巨噬細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用。本研究將為牡丹籽粕多糖在食品、保健品、美容、醫(yī)藥等領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)，為牡丹籽粕的高值化利用提供參考。