吳晟，崔樹茂，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

益生菌是一類攝入人體后對(duì)腸道環(huán)境有益的活性微生物[1]，其中乳酸菌屬及雙歧桿菌屬最為常見(jiàn)。干酪乳桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，常見(jiàn)于發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳等食品及人體腸道內(nèi)[2]，在厭氧或兼性厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)良好。干酪乳桿菌能黏附于腸道上皮細(xì)胞進(jìn)而定植于腸道，并代謝生成短鏈脂肪酸等產(chǎn)物[3-4]，酸化腸道環(huán)境，抑制單增李斯特菌[5]、金黃色葡萄球菌[6]、沙門氏菌、大腸桿菌[7]等致病菌的定植；能夠發(fā)酵牛奶中的乳糖并制備成酸奶，對(duì)于乳糖不耐癥患者是一大福音；干酪乳桿菌對(duì)代謝綜合癥的緩解作用也較為顯著[8]。

乳酸菌廣泛的益生功效備受關(guān)注，如何高效制備乳酸菌制劑一直被不斷探索，真空冷凍干燥法是目前生產(chǎn)生物活性制劑的主要手段。為了提高凍干后菌株的存活率、單位質(zhì)量菌粉所含活菌數(shù)以及菌粉的貨架期穩(wěn)定性[9]，各種糖類[10]、蛋白質(zhì)以及一些小分子化合物[11-13]對(duì)菌體的保護(hù)作用被深入剖析。已發(fā)現(xiàn)糖類的凍干保護(hù)效果優(yōu)于其他類保護(hù)劑，且低聚糖對(duì)乳桿菌的凍干保護(hù)效果最好[14]；亦有研究認(rèn)為，海藻糖的凍干保護(hù)效果最好[15]，它具有低流動(dòng)性、高黏度和高玻璃轉(zhuǎn)化溫度，能夠在凍干過(guò)程形成玻璃態(tài)保護(hù)菌體蛋白功能[16]，并且通過(guò)氫鍵替代水化層穩(wěn)定脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

凍干保護(hù)劑的使用確實(shí)提高了乳酸菌制劑的制備效率，但是很難僅通過(guò)優(yōu)化保護(hù)劑進(jìn)一步提高制備效率。通過(guò)提高菌體抗逆性和凍干存活率亦被研究，如酸脅迫、低溫脅迫、滲透壓脅迫等，但是菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中不可避免產(chǎn)生的表面物質(zhì)對(duì)菌體凍干存活的影響一直被忽視。乳酸菌表面物質(zhì)主要是由莢膜多糖和表面蛋白組成。莢膜多糖依靠糖的多羥基結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜表面的磷脂產(chǎn)生氫鍵作用，附著于細(xì)胞表面；表面蛋白也是菌體表面物質(zhì)的一種，包括S層蛋白、膜蛋白、分泌蛋白與其他表面蛋白。已有研究表明，莢膜多糖和表面蛋白對(duì)菌體有一定的保護(hù)作用，能夠幫助菌體抵御外界的惡劣環(huán)境[17-19]。但是菌體表面物質(zhì)與凍干保護(hù)劑對(duì)菌體的凍干保護(hù)效果是否有差異，在已有高效保護(hù)劑的條件下增加或減少表面物質(zhì)對(duì)菌體凍干存活是否有影響，至今均無(wú)定論。菌體自身表面物質(zhì)與細(xì)胞膜的結(jié)合可能使其較外源添加的保護(hù)劑能更有效地保護(hù)菌體細(xì)胞膜的完整性或流動(dòng)性，這種結(jié)合亦可能影響保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)。故本研究選擇水蘇糖、海藻糖及菊粉作為凍干保護(hù)劑，通過(guò)物理剝離和發(fā)酵控制的方法探索表面物質(zhì)的產(chǎn)生及產(chǎn)量對(duì)干酪乳桿菌凍干存活的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌17005、干酪乳桿菌173011CQQJ3、干酪乳桿菌PS5-4，來(lái)自于江南大學(xué)食品生物技術(shù)菌種保藏中心，由人類糞便中篩選得到。

1.1.2 試劑

K2HPO4·3H2O、MnSO4·H2O、MgSO4、K2SO4、CuSO4、NaCl、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水葡萄糖、1水合乳糖、檸檬酸氫二胺、L-半胱氨酸鹽酸鹽、瓊脂粉、H2SO4、無(wú)水乙醇、蒽酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉和蛋白胨，蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；阿拉伯糖、海藻糖、水蘇糖及菊粉，上海創(chuàng)賽科技有限公司；酵母浸粉FM 528，安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；保興BIOTECH-3000發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；SW-CJ-1CU型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；K1100凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Telstar Lyobeta 5ps 凍干機(jī)，西班牙泰事達(dá)公司；超聲破碎儀JY92-IIDN，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化及培養(yǎng)

取凍存于-80 ℃的保菌管，接種環(huán)蘸取少量菌液后在MRS固體平板劃線純化，置于37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，挑取單菌落接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，即得菌株的種子液。

1.3.2 干酪乳桿菌表面物質(zhì)的剝離

采用物理超聲法對(duì)穩(wěn)定期收集的菌體進(jìn)行表面物質(zhì)的剝離[20]，具體操作如下：離心(8 000×g,15 min)收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌體，生理鹽水洗滌兩次，菌泥按照1∶1(g∶mL)重懸于1 mol/L NaCl溶液混勻后，分別置于63、72、81、90 W的功率條件下，冰浴超聲6、12、18 min，超聲前后取樣測(cè)定菌懸液中菌體的活菌數(shù)，計(jì)算超聲后的存活率。

1.3.3 表面物質(zhì)剝離前后干酪乳桿菌的透射電鏡觀察

按1.3.2中得到的最優(yōu)條件剝離菌體表面物質(zhì)后，用體積分?jǐn)?shù)為4%戊二醛前固定，隨后加入1 mg/mL 四氧化鋨后固定，最后用75%乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制備超薄切片，乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行切片染色，完成后置于透射電鏡下觀察[21]。

1.3.4 表面物質(zhì)剝離前后干酪乳桿菌的凍干

離心(8 000×g,15 min)收獲穩(wěn)定期的菌體后，取4份濕菌泥樣品，每份1 g，分別添加1 mL的生理鹽水、200 g/L水蘇糖溶液、200 g/L海藻糖溶液和200 g/L菊粉溶液，充分混勻后進(jìn)行凍干；另取4份濕菌泥樣品，每份1 g，按照最優(yōu)超聲條件剝離表面物質(zhì)，離心(8 000×g,15 min)收集表面物質(zhì)被剝離后的菌泥，分別添加1 mL的生理鹽水、200 g/L水蘇糖溶液、200 g/L海藻糖溶液和200 g/L菊粉溶液，并分別用無(wú)菌水定容至與未剝離組菌懸液相同體積(確保凍干前剝離組與未剝離組活菌數(shù)一致，保護(hù)劑濃度和比例一致)，充分混勻后進(jìn)行凍干。

凍干條件：預(yù)凍，控制層板1 h內(nèi)降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.5 凍干樣品的活菌數(shù)及存活率計(jì)算

將凍干樣品以無(wú)菌水復(fù)溶至凍干前體積，采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并根據(jù)公式(1)計(jì)算凍干存活率：

(1)

1.3.6 干酪乳桿菌表面物質(zhì)含量的測(cè)定

以1.3.2中得到的最優(yōu)條件剝離菌體表面物質(zhì)，超聲結(jié)束后離心(8 000×g,20 min)取上清液，用于莢膜多糖和表面蛋白的測(cè)定。其單位菌體表面物質(zhì)含量為單位菌體莢膜多糖與表面蛋白含量之和。

莢膜多糖含量的測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法[22]：稱取0.2 g蒽酮溶解于100 mL的體積分?jǐn)?shù)為81%的H2SO4，取適量上清液按一定比例稀釋至1 mL，加入4 mL H2SO4-蒽酮溶液，沸水浴10 min后取出并冷卻至室溫，測(cè)定OD620，根據(jù)公式(2)計(jì)算莢膜多糖含量(mg/CFU):

(2)

表面蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[23]：稱取3.6 g K2SO4和0.4 g CuSO4作為消化催化劑加至消化管，取1 mL上清液及10 mL濃H2SO4加入消化管，置于石墨爐上消化。消化程序?yàn)?20 ℃/2 min，180 ℃/2 min，240 ℃/30 min，350 ℃/60 min，420 ℃/60 min，待樣品冷卻至室溫后進(jìn)行滴定，所得蛋白濃度即為每1 mL上清液中蛋白濃度，根據(jù)樣品體積及濃度計(jì)算得到樣品的總蛋白濃度，并根據(jù)公式(3)計(jì)算單位菌體表面蛋白含量(mg/CFU)：

1.3.7 不同發(fā)酵條件下菌體表面物質(zhì)含量測(cè)定與凍干

1.3.7.1 不同碳氮比

配制碳氮比為4∶1、4∶3的發(fā)酵培養(yǎng)基各3 L，氮源為酵母浸粉FM 528，葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L，其余營(yíng)養(yǎng)成分參考MRS培養(yǎng)基。干酪乳桿菌17005按1.3.1的條件活化后，以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行pH6.0、37 ℃恒溫培養(yǎng)，并分別于對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期收集菌體，一部分菌泥用于單位菌體表面物質(zhì)含量的測(cè)定，一部分菌泥以質(zhì)量體積比1∶1(g∶mL)添加200 g/L水蘇糖進(jìn)行凍干，測(cè)定凍干前后活菌數(shù)并計(jì)算存活率

1.3.7.2 不同碳源

以葡萄糖、阿拉伯糖為碳源，配制2種不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基。其中質(zhì)量碳源濃度為20 g/L，氮源(酵母浸粉FM 528)質(zhì)量濃度為15 g/L、無(wú)機(jī)鹽、微量元素與MRS培養(yǎng)基一致。菌株按1.3.1的條件活化后，以2%接種量接種于5 L發(fā)酵罐(裝液量為3 L)，菌株培養(yǎng)及收集方式及凍干條件參考1.3.7.1。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)值的測(cè)定均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。數(shù)據(jù)分析采用Graphpad 7.0完成，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。顯著性采用T檢驗(yàn)分析，P<0.05為數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結(jié)果討論

2.1 干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離的最優(yōu)條件

將菌體重懸于1 mol/L NaCl溶液中，由于高滲透壓作用菌體產(chǎn)生收縮，其表面物質(zhì)與細(xì)胞壁之間的空隙增大，在超聲的空化作用下表面物質(zhì)更易于破碎溶出[24]。圖1表明在較低功率(63和72 W)時(shí)，菌體的活性均不受影響，即使延長(zhǎng)超聲時(shí)間，菌體活性依然未有損失。超聲功率繼續(xù)提高后，不同菌株的耐受性呈現(xiàn)出差異。干酪乳桿菌173011CQQJ3和干酪乳桿菌PS5-4對(duì)超聲具有較強(qiáng)的耐受能力，只在90 W功率超聲18 min時(shí)存活率有所下降；干酪乳桿菌17005在81和90 W時(shí)超聲較短的時(shí)間，其活性不受影響，但超聲時(shí)間達(dá)到18 min，存活率顯著降低。過(guò)高的超聲頻率及時(shí)間會(huì)使菌體破裂，且超聲過(guò)程中會(huì)由于水分子高速運(yùn)動(dòng)不斷釋放熱量，影響菌體活性。為了確保菌體表面物質(zhì)被完全剝離，在菌體活性保持無(wú)損失的前提下采取最大的超聲功率和超聲時(shí)間，即干酪乳桿菌17005、干酪乳桿菌173011CQQJ3、干酪乳桿菌PS5-4表面物質(zhì)剝離條件分別為90 W/6 min、90 W/12 min、90 W/12 min；并通過(guò)透射電鏡驗(yàn)證最優(yōu)條件處理后的干酪乳桿菌17005表面物質(zhì)的剝離情況。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌PS5-4圖1 干酪乳桿菌在不同超聲條件下的存活率Fig.1 The survival rate of different L.casei under different ultrasonic conditions注：*表示在P<0.05上具有顯著性差異；**表示在P<0.01上具有顯著性差異；***表示在P<0.001上具有顯著性差異；****表示在P<0.0001上具有顯著性差異(下同)

a-未剝離組; b-剝離組圖2 表面物質(zhì)剝離前后的干酪乳桿菌形態(tài)Fig.2 The morphological characteristics of L.casei before and after the surface material stripped

對(duì)比圖2-a及圖2-b發(fā)現(xiàn),剝離組菌體的表面物質(zhì)被顯著剝離，且視野中的菌體完整無(wú)損傷，證實(shí)了該方法的可行性及有效性。干酪乳桿菌17005的濕菌泥經(jīng)過(guò)超聲處理后，再離心收集的菌泥濕重約為處理前的70%左右，進(jìn)一步證實(shí)了表面物質(zhì)被高效剝離；但是處理后干重僅降低7%，即1 g濕菌泥僅有0.015 g的表面物質(zhì)，也證實(shí)了菌體的表面物質(zhì)可以與培養(yǎng)基中水分子通過(guò)氫鍵結(jié)合,一方面增加了菌泥的含水量降低菌體收集效率，另一方面這層特殊的結(jié)構(gòu)可能對(duì)菌體的凍干存活產(chǎn)生影響。

2.2 表面物質(zhì)對(duì)于菌體凍干存活率及活菌數(shù)的影響

2.2.1 無(wú)保護(hù)劑條件下干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后凍干存活率

為了研究干酪乳桿菌表面物質(zhì)的凍干保護(hù)作用，將表面物質(zhì)剝離前后的3株干酪乳桿菌重懸于生理鹽水中凍干，其凍干存活率如圖3。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖3 三株干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后混合生理鹽水的凍干存活率Fig.3 The freeze-drying survial rate of three strains of L.casei with saline solution before and after the surface substance stripped注：NS表示沒(méi)有顯著性差異(P<0.05)(下同)

在沒(méi)有保護(hù)劑的條件下，3株菌的死亡率均超過(guò)90%。雖然表面物質(zhì)未剝離對(duì)菌體的凍干存活略有提高，但僅依靠表面物質(zhì)對(duì)菌體的保護(hù)作用，不足以降低凍干對(duì)菌體造成的損失。為比較單位質(zhì)量表面物質(zhì)和單位質(zhì)量保護(hù)劑(水蘇糖或海藻糖)對(duì)菌體的保護(hù)差異，在菌體表面物質(zhì)剝離后，將其置于含有與表面物質(zhì)等量的保護(hù)劑溶液中(10 g/L)，但結(jié)果表明存活率未有顯著差異(數(shù)據(jù)結(jié)果未列出)。在這種低量的情況下，無(wú)論是菌體自身的表面物質(zhì)，還是保護(hù)劑均無(wú)法有效保持菌株在凍干過(guò)程中的活性。要確保菌株凍干后的活性，依然需要大量的凍干保護(hù)劑。但是表面物質(zhì)均是大分子結(jié)構(gòu)，附著在菌體表面以多種形式與細(xì)胞膜結(jié)合，其是否會(huì)影響保護(hù)劑對(duì)菌體的凍干保護(hù)作用？ DIMOPOULOU等[17]研究酒球菌屬的胞外多糖及凍干存活率關(guān)系時(shí)總結(jié)道，在麥芽糊精與蔗糖作保護(hù)劑時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)生能夠顯著提高酒球菌屬的凍干存活率。因此應(yīng)該添加保護(hù)劑對(duì)表面物質(zhì)及保護(hù)劑的保護(hù)效果差異進(jìn)行研究。

2.2.2 以水蘇糖或海藻糖作為保護(hù)劑條件下干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后凍干存活率

將剝離表面物質(zhì)前后的菌體以水蘇糖作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干，其凍干存活率如圖4所示。表面物質(zhì)剝離后3株干酪乳桿菌的凍干存活率均有不同程度的提高。干酪乳桿菌17005、173011CQQJ3及PS5-4未剝離組的存活率分別為(30.46±6.08)%、(23.82±8.68)%、(35.71±3.59)%，而表面物質(zhì)剝離后存活率分別達(dá)到了(49.73±4.51)%、(35.71±3.59)%、(38.89±10.39)%。為了排除剝離過(guò)程中1 mol/L 的NaCl溶液對(duì)于菌株凍干活性的影響，分別將菌體重懸于1 mol/L的NaCl溶液和生理鹽水中且不進(jìn)行超聲，靜置半小時(shí)后凍干，其凍干存活率如圖5所示，未處理組與高滲處理組的3株干酪乳桿菌凍干存活率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明短時(shí)間的高滲透壓環(huán)境對(duì)菌株凍干存活率沒(méi)有顯著影響。結(jié)果表明在以水蘇糖作為保護(hù)劑時(shí)，無(wú)表面物質(zhì)的干酪乳桿菌凍干存活率顯著提高。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖4 三株干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后以水蘇糖為保護(hù)劑的凍干存活率Fig.4 The survival rate of three strains of L.casei before and after the surface substance stripped with stachyose as cryoprotectant

圖5 三株干酪乳桿菌高滲透壓處理前后的凍干存活率Fig.5 The freeze-drying survial rate of three strains of L.casei before and after processed in hyperosmotic media

以海藻糖作為保護(hù)劑時(shí)，得到與水蘇糖作為保護(hù)劑一樣的規(guī)律。結(jié)果如圖6所示，3株干酪乳桿菌在表面物質(zhì)剝離前后以海藻糖作為保護(hù)劑時(shí)凍干存活率均有一定的提高，說(shuō)明在以最適的小分子糖為保護(hù)劑時(shí)，菌體產(chǎn)生的大分子表面物質(zhì)會(huì)影響小分子糖對(duì)菌體的凍干保護(hù)。越來(lái)越多的證明表明，小分子糖類保護(hù)劑與細(xì)胞膜的結(jié)合，維持其完整性和流動(dòng)性是菌體減少凍干損失的主要原因。表面物質(zhì)作為大分子，其在凍干過(guò)程中對(duì)菌體的保護(hù)作用可能不及小分子糖類保護(hù)劑，且亦會(huì)影響小分子羥基類物質(zhì)與細(xì)胞膜的結(jié)合。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖6 三株干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后以海藻糖為保護(hù)劑的凍干存活率Fig.6 The survial rate of three strains of L.casei before and after the surface substance stripped with trehalose as cryoprotectant

2.2.3 以菊粉為保護(hù)劑的條件下干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后凍干存活率

菊粉是不同聚合度的大、小分子聚果糖的混合物，相對(duì)分子量顯著高于水蘇糖和海藻糖。結(jié)果如圖7所示，在以大分子菊粉為保護(hù)劑時(shí)，3株菌的凍干存活率均較低，且表面物質(zhì)剝離后，存活率降低。表明在以大分子為保護(hù)劑時(shí)，菌體表面物質(zhì)的存在利于對(duì)菌的凍干保護(hù)。大分子保護(hù)劑不像小分子糖類能夠穿透細(xì)胞壁，與細(xì)胞膜緊密結(jié)合，在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間形成有效的保護(hù)層結(jié)果表明。在以小分子糖類為保護(hù)劑時(shí)，菌體的表面物質(zhì)作為大分子附著在菌體表面可能影響小分子羥基類物質(zhì)對(duì)菌體的保護(hù)；在以大分子多羥基類物質(zhì)為保護(hù)劑時(shí)，表面物質(zhì)因其與菌體更好的結(jié)合，體現(xiàn)出較大分子保護(hù)劑更優(yōu)的保護(hù)作用。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-ps5-4圖7 三株干酪乳桿菌表面物質(zhì)剝離前后以菊粉為保護(hù)劑的凍干存活率Fig.7 The survial rate of three L.casei before and after stripping the surface substance with inulin as cryoprotectant

2.3 干酪乳桿菌表面物質(zhì)分析

基于2.2中表面物質(zhì)影響小分子糖對(duì)菌體凍干保護(hù)的假設(shè)，對(duì)3株干酪乳桿菌的表面物質(zhì)成分進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果如圖8所示。3株干酪乳桿菌表面物質(zhì)中大部分是表面蛋白，多糖僅占很少比例。譚莎莎等[14]研究乳桿菌凍干保護(hù)規(guī)律時(shí)總結(jié)羥基類保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果顯著優(yōu)于蛋白類物質(zhì)，因羥基基團(tuán)能夠與菌體細(xì)胞膜形成緊密氫鍵結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)；且海藻糖和水蘇糖在凍干過(guò)程中能夠形成高黏度、低流動(dòng)的玻璃態(tài)介質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水化層被破壞后，代替水化層保護(hù)蛋白質(zhì)的功能；而大分子的蛋白類物質(zhì)起不到該方面的保護(hù)作用，表面物質(zhì)的高蛋白可能是其影響水蘇糖和海藻糖凍干保護(hù)效果的主要原因。

圖8 干酪乳桿菌單位菌體糖含量及蛋白含量Fig.8 The polysacharide and protein content of L.casei

2.4 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株表面物質(zhì)的產(chǎn)量及凍干存活的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證表面物質(zhì)含量與菌體凍干存活率的關(guān)系，以干酪乳桿菌17005作為研究對(duì)象，通過(guò)改變發(fā)酵條件探索表面物質(zhì)產(chǎn)量與干酪乳桿菌的凍干存活率的關(guān)系，分別從培養(yǎng)基的碳氮比，碳源種類2方面進(jìn)行分析。

2.4.1 不同碳氮比發(fā)酵對(duì)菌株表面物質(zhì)及凍干存活率的影響

有研究表明，過(guò)高的碳氮比會(huì)增加微生物胞外多糖的產(chǎn)生[25]。因此，以高碳氮比和低碳氮比分別培養(yǎng)干酪乳桿菌17005，分析對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期菌體的表面物質(zhì)的產(chǎn)生和凍干存活率。結(jié)果如表1所示，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(8 h)高碳氮比培養(yǎng)的干酪乳桿菌17005較低碳氮比產(chǎn)生更多的表面物質(zhì)，且進(jìn)一步影響了菌體的凍干存活率，較低的表面物質(zhì)的產(chǎn)生利于對(duì)數(shù)期菌體的凍干存活。但是在穩(wěn)定期(14 h)收集的菌體，雖然高碳氮比較低碳氮比亦產(chǎn)生較多的表面物質(zhì)，凍干存活率卻無(wú)顯著性差異。且穩(wěn)定期收集的菌體比對(duì)數(shù)期的菌體產(chǎn)生更多的表面物質(zhì)，而凍干存活率并未降低。說(shuō)明在穩(wěn)定期培養(yǎng)環(huán)境的饑餓脅迫和高滲脅迫(80 g/L碳源發(fā)酵結(jié)束環(huán)境滲透壓較高)提高的菌體抗逆性是除保護(hù)劑之外保持菌體凍干活性的主要因素[26]，表面物質(zhì)產(chǎn)生的多少并不會(huì)顯著影響穩(wěn)定期菌株的凍干存活率。

表1 干酪乳桿菌17005單位菌體表面物質(zhì)含量及凍干存活率Table 1 The content of surface substance of each L.casei 17005 cell and its freeze-drying survival rate

2.4.2 不同碳源發(fā)酵對(duì)菌體的表面物質(zhì)含量及凍干存活率的影響

碳源的種類會(huì)顯著影響莢膜的產(chǎn)生，戊糖無(wú)法被乳酸菌磷酸化生成6-磷酸葡萄糖參與莢膜合成途徑[27]，阿拉伯糖是戊糖，較葡萄糖產(chǎn)生更少的表面物質(zhì)(表2)。在對(duì)數(shù)期，阿拉伯糖培養(yǎng)的菌體表面物質(zhì)含量顯著低于葡萄糖培養(yǎng)的菌體，其凍干存活率亦與表面物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與不同碳氮比發(fā)酵培養(yǎng)形成的結(jié)果一致。但在穩(wěn)定期，菌體的凍干存活率與表面物質(zhì)的關(guān)系與2.4.1的結(jié)果相反，這可能是該組實(shí)驗(yàn)采取的是20 g/L的碳源，發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓并未達(dá)到對(duì)菌體產(chǎn)生滲透脅迫的條件，且阿拉伯糖的利用效率低，發(fā)酵12 h依然有阿拉伯糖尚未完全利用，此時(shí)菌體未受到的饑餓和高滲脅迫，表面物質(zhì)對(duì)菌體凍干存活的影響是主要因素；且表面物質(zhì)的含量超過(guò)一定量(單位菌體表面物質(zhì)含量>1.6×10-10mg/CFU)時(shí)，其對(duì)水蘇糖的保護(hù)效果的影響不再變化。因此，在不受到其他脅迫影響的條件下，干酪乳桿菌菌體的凍干存活與表面物質(zhì)的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)，表面物質(zhì)產(chǎn)生的越多，越會(huì)降低水蘇糖對(duì)菌體的凍干保護(hù)。

表2 不同碳源發(fā)酵后干酪乳桿菌17005單位菌體表面物質(zhì)含量及凍干存活率Table 2 The content of surface substance of each L.casei 17005 cell under different carbon sources fermentation conditions and freeze-drying survival rate

3 結(jié)論

干酪乳桿菌的表面物質(zhì)包括表面蛋白與莢膜多糖，且表面蛋白含量顯著高于多糖含量。表面物質(zhì)被剝離后，以海藻糖或水蘇糖作為保護(hù)劑時(shí)菌體的凍干存活率顯著提高，表面物質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)降低糖類對(duì)菌體的凍干保護(hù)作用。以阿拉伯糖作為底物碳源相較于葡萄糖可有效減少菌體表面物質(zhì)的產(chǎn)生，提高菌體以水蘇糖或海藻糖作為保護(hù)劑時(shí)的凍干存活率；降低發(fā)酵過(guò)程的碳氮比亦均可有效減少干酪乳桿菌表面物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而提高對(duì)數(shù)期菌體以水蘇糖或海藻糖作為保護(hù)劑時(shí)的凍干存活率。