董世榮，王麗，高昂，徐微

1(哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院食品系，黑龍江 哈爾濱，150086)2(濟(jì)南市第二藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南，271100)

乳液在食品、化妝品、生物技術(shù)和醫(yī)藥產(chǎn)品等領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用[1]，其是2種互不相容液體(一般為油和水)組成的非均相分散體系，一種液體以細(xì)液滴形式均勻地分散在另一種液體中，它們?cè)跓崃W(xué)上是不穩(wěn)定的，乳化液很容易發(fā)生絮凝、乳脂化、沉降、聚結(jié)、相轉(zhuǎn)化等[2]。通過(guò)添加乳化劑，在均質(zhì)化過(guò)程中，乳化劑吸附在液滴表面而降低界面張力，進(jìn)而改善乳液的穩(wěn)定性[1]。近年來(lái)，天然高分子材料如蛋白質(zhì)、多糖、磷脂常作為乳化劑應(yīng)用到食品領(lǐng)域。

玉米醇溶蛋白是一種從玉米粉中分離出的植物蛋白質(zhì)，因具有良好的生物降解性、環(huán)保、無(wú)毒、成膜性、可食用性等優(yōu)點(diǎn)而被作為一種有價(jià)值的食品原料[3]。玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有超過(guò)50%的非極性氨基酸而具有較強(qiáng)的疏水性[4]，因此不易溶于水而易分散在50%～90%的乙醇-水溶液中。MATSUSHIMA等[5]提出玉米醇溶蛋白是1個(gè)13 nm×1.2 nm×3 nm的棱鏡模型，該模型中含有9～10個(gè)以反平行方式排列的螺旋段，螺旋兩端由富含谷氨酰胺的橋連接。基于此模型，螺旋外表面形成的棱柱體的側(cè)面是疏水的，而富含谷氨酰胺的棱柱體的上下表面是親水的，因此玉米醇溶蛋白屬于雙親性蛋白質(zhì)[6]，但是由于玉米醇溶蛋白的剛性太強(qiáng)，不能作為良好的乳化劑使用。

為了改善玉米醇溶蛋白的剛性結(jié)構(gòu)，很多研究人員采用了堿、酶、熱處理、復(fù)合等方式修飾玉米醇溶蛋白。張京京等[7]利用堿性蛋白酶修飾玉米醇溶蛋白，改善了玉米醇溶蛋白的乳化性。趙城彬等探究了葡聚糖接枝作用對(duì)玉米醇溶蛋白乳化性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接枝反應(yīng)能夠提高玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[8]。CABRA等利用堿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行脫酰胺修飾，發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性從(18±0.7)%增加至(80±4.7)%[9]。李丹等研究發(fā)現(xiàn)脫酰胺的乳清分離蛋白的乳化穩(wěn)定性比未脫酰胺乳化穩(wěn)定性高[10]。SELLING等在25～70 ℃條件下熱處理玉米醇溶蛋白，發(fā)現(xiàn)70 ℃加熱15 min可以改變玉米醇溶蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。柔性是決定蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要因素之一，分子柔性實(shí)質(zhì)上反應(yīng)了蛋白質(zhì)構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)性，而功能性質(zhì)如乳化性質(zhì)與蛋白質(zhì)構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)性密切相關(guān)[12]。這些研究說(shuō)明了采用堿、熱等方式可以改變玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)和乳化特性，而且堿修飾使得玉米醇溶蛋白發(fā)生脫酰胺反應(yīng)，從而改善玉米醇溶蛋白的乳化性。但是脫酰胺度對(duì)乳化性影響規(guī)律，以及脫酰胺度對(duì)玉米醇溶蛋白構(gòu)象的影響并沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此，本研究在堿-水介質(zhì)環(huán)境中利用堿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行脫酰胺，通過(guò)控制加熱時(shí)間調(diào)節(jié)脫酰胺度，研究脫酰胺度與玉米醇溶蛋白乳化穩(wěn)定性和乳化活性的變化規(guī)律，同時(shí)分析了脫酰胺的玉米醇溶蛋白分子構(gòu)象、柔性的變化，以期為開(kāi)發(fā)玉米醇溶蛋白天然乳化劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Z3625型玉米醇溶蛋白、胰蛋白酶、十二烷基磺酸鈉，美國(guó)Sigma公司；大豆油，九三集團(tuán)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4500熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；UV-2550 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

將玉米醇溶蛋白分別分散至均含有7.5 mmol/L NaOH的水溶液、50%、60%、70%、80%、90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇-水溶液等6種介質(zhì)中，在室溫下磁力攪拌1 h，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的6份不同的玉米醇溶蛋白溶液，然后在65 ℃加熱不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)。將不同處理后的玉米醇溶蛋白溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，然后凍干，作為后續(xù)試驗(yàn)樣品。

1.2.2 脫酰胺度的測(cè)定

采用苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定脫酰胺度[13]。

試劑A的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，加入雙蒸水定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

試劑B的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g NaOH并溶于雙蒸水中，移取4.2 mL次氯酸鈉溶液加入到NaOH溶液中，并定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑A于試管中，加入20 μL不同濃度的(NH4)2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/L)或者待測(cè)樣品，充分振蕩、混勻。然后準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。迅速轉(zhuǎn)移至水浴鍋中，在37 ℃下水浴顯色20 min。然后冷卻至室溫，在625 nm處測(cè)定溶液吸光值。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

根據(jù)所測(cè)定的樣品游離氨含量及總酰胺含量，按公式(1)計(jì)算脫酰胺度:

(1)

1.2.3 乳化性的測(cè)定

參照PEARCE等的濁度法[14]測(cè)定乳化活性和乳化穩(wěn)定性。分別取3 mL質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白溶液和1 mL一級(jí)大豆油混合，12 000 r/min均質(zhì)1 min，靜置，分別在0 min和10 min從距離容器底部0.5 cm處的相同位置取50 μL乳狀液于裝有5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的SDS溶液中，旋渦振蕩，混合均勻，然后在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，其中以1 mg/mL的SDS溶液進(jìn)行調(diào)零。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性按照公式(2)和公式(3)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

(3)

式中：T=2.303；A0，乳化液靜置0 min時(shí)在500 nm下的吸光值；ρ，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；φ，油在溶液中的體積分?jǐn)?shù)，%；n,稀釋倍數(shù)；A10，乳化液靜置10 min時(shí)在500 nm下的吸光值。

1.2.4 內(nèi)源性熒光光譜的測(cè)定

參照DEL等的方法[15]，使用熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行熒光掃描。具體參數(shù)如下：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射光譜為290～450 nm，掃描速度100 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，電壓700 mV。每個(gè)樣品測(cè)定重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)均在室溫下收集。

1.2.5 紫外吸收光譜的測(cè)定

紫外吸收光譜的測(cè)定參考SUN等的方法[16]，將樣品濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)瑨呙璺秶?00～450 nm，掃描速度200 nm/s。

1.2.6 表面疏水性熒光光譜的測(cè)定

以8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)為熒光劑，參照CHAUDHURI等[17]的方法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行表面疏水性熒光光譜掃描。將待測(cè)樣品用0.01 mol/L的磷酸緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為0.015 mg/mL，然后加入20 μL的8 mmol/L的ANS溶液，利用旋渦振蕩器混勻，避光室溫下反應(yīng)15 min，然后在激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～600 nm進(jìn)行掃描，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫均為5 nm，試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，每個(gè)樣品掃描3次，獲得表面疏水性熒光光譜。

1.2.7 分子柔性的測(cè)定

以蛋白質(zhì)對(duì)胰蛋白酶的敏感度表征分子柔性[18]，利用0.05 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制1 mg/mL胰蛋白酶溶液。取250 μL胰蛋白酶液加入到4 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL脫酰胺修飾后的玉米醇溶蛋白溶液〔m(蛋白)∶m(酶)=16∶1〕中，38 ℃水浴恒溫5 min，反應(yīng)結(jié)束后加4 mL質(zhì)量濃度為50 g/L三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液測(cè)定其在280 nm下的吸光度，用吸光度A表征量化柔性的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)脫酰胺度的影響

研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白在不同溶劑(0、50%、60%、70%、80%、90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇-水溶液)中脫酰胺度隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖1)。

a-0%乙醇; b-50%乙醇; c-60%乙醇; d-70%乙醇; e-80%乙醇; f-90%乙醇圖1 在不同加熱時(shí)間條件下乙醇濃度對(duì)脫酰胺度的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on deamidation degree of zein at different heating time

由圖1可知，其中在水溶劑中脫酰胺度的變化幅度最大，從加熱0 h的0.89%增加至加熱10 h的34.70%。玉米醇溶蛋白分散至堿-水介質(zhì)時(shí)需要一定時(shí)間，在溶解期間也發(fā)生了脫酰胺反應(yīng)。在含有7.5 mmol/L的NaOH的50%、60%、70%、80%、90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇-水溶液中，玉米醇溶蛋白在加熱0 h時(shí)的脫酰胺度幾乎為0，當(dāng)加熱10 h時(shí)，玉米醇溶蛋白的脫酰胺度分別為3.06%、1.95%、1.89%、1.69%、1.35%，表明脫酰胺度隨著乙醇濃度的增加而呈現(xiàn)變小的趨勢(shì)。而且與玉米醇溶蛋白在水溶劑中的脫酰胺度相比，在乙醇-水溶液中玉米醇溶蛋白的脫酰胺度均很小。改變?nèi)軇╊?lèi)型可改變玉米醇溶蛋白的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而改變其反應(yīng)位點(diǎn)的可接近性[11]。為研究脫酰胺度對(duì)玉米醇溶蛋白的界面性質(zhì)的影響，選用堿-水作為溶劑對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行脫酰胺作用。

2.2 脫酰胺度對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是直接反應(yīng)乳化特性的重要指標(biāo)。不同脫酰胺度玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性見(jiàn)圖2。

圖2 脫酰胺度對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of deamidation degree on the emulsion active index and emulsion stability

圖2乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著脫酰胺度的增加均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。玉米醇溶蛋白在脫酰胺度較低(DD=0.89%)時(shí)，乳化活性?xún)H為1.07 m2/g，可能是因?yàn)榇藭r(shí)玉米醇溶蛋白表面活性較低[19]，無(wú)法很好地形成良好的乳化液。但是當(dāng)脫酰胺度增加至34.70%時(shí)，玉米醇溶蛋白的乳化活性增加至3.69 m2/g，增加的幅度達(dá)244.86%。脫酰胺度的提高也改善了玉米醇溶蛋白乳化液的穩(wěn)定性，當(dāng)脫酰胺度從0.89%增加至34.70%時(shí)，玉米醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性從6.32%增加至73.05%，增加的幅度為1 055.85%。脫酰胺度較低的玉米醇溶蛋白黏度較低、表面疏水力較高，促進(jìn)了乳化液滴的聚集絮凝[20]，從而表現(xiàn)出較差的乳化穩(wěn)定性。除了黏度和表面疏水性，分子柔性也是影響蛋白質(zhì)乳化性的重要因素，因?yàn)榉肿尤嵝钥梢源龠M(jìn)蛋白質(zhì)分子和油表面的相互作用[9]，脫酰胺度可能會(huì)改變玉米醇溶蛋白的分子柔性。

2.3 脫酰胺度對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性歸一化結(jié)果的影響

為定量反映脫酰胺度對(duì)玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響規(guī)律，本研究采用單指數(shù)函數(shù)擬合脫酰胺度和歸一化的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的關(guān)系〔乳化活性歸一化(EAIg)：不同脫酰胺度時(shí)的乳化活性與脫酰胺度為0.89%時(shí)平均乳化活性的比值；乳化穩(wěn)定性歸一化(ESIg)：不同脫酰胺度時(shí)的乳化穩(wěn)定性與脫酰胺度為0.89%時(shí)平均乳化穩(wěn)定性的比值〕。如圖3所示。

a-乳化活性歸一化-脫酰胺度; b-乳化穩(wěn)定性歸一化-脫酰胺度圖3 脫酰胺度對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性歸一化結(jié)果的影響Fig.3 The regressed result of generalized emulsion active index and emulsion stability as a function of deamidation degree

EAIg和ESIg最小二乘法回歸分析可表示為:

EAIg=0.063 84x+1.322 5

(4)

ESIg=0.316 75x+0.288 64

(5)

2.4 脫酰胺后表面疏水性的變化

表面疏水性反映了蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)含量，與蛋白質(zhì)的性質(zhì)息息相關(guān)。本試驗(yàn)采用ANS熒光探針的方法對(duì)玉米醇溶蛋白的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定。從圖4可以看出，脫酰胺度在0.89%時(shí)，玉米醇溶蛋白表現(xiàn)出較高的表面疏水性；當(dāng)脫酰胺度增加至34.70%時(shí)，玉米醇溶蛋白的表面疏水性降低。脫酰胺反應(yīng)使得疏水酰胺基團(tuán)形成親水性的羧基，從而降低了蛋白質(zhì)的表面疏水性[21]。

圖4 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的表面疏水性的變化Fig.4 Surface hydrophobicity change of zein at various deamidation degree

2.5 內(nèi)源性熒光光譜分析

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是蛋白質(zhì)中發(fā)射內(nèi)源性熒光的氨基酸，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，內(nèi)源性熒光通常取決于色氨酸和酪氨酸殘基，與酪氨酸相比，色氨酸對(duì)環(huán)境變化更敏感，因此內(nèi)源性熒光的強(qiáng)度主要來(lái)源于色氨酸[22]。通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)中色氨酸的熒光強(qiáng)度變化可以反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、折疊和展開(kāi)參數(shù)以及動(dòng)態(tài)變化[23]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，發(fā)色團(tuán)暴露于溶劑中會(huì)降低熒光強(qiáng)度[24-25]。從圖5看出，在玉米醇溶蛋白脫酰胺度(DD=0.89%)很低時(shí)，色氨酸發(fā)色團(tuán)的峰值約330 nm，這是色氨酸在一個(gè)相對(duì)疏水環(huán)境中的一個(gè)特定峰值[24]。但是當(dāng)玉米醇溶蛋白的脫酰胺度達(dá)到34.70%時(shí)，內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的峰值消失，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的峰值，可能由于脫酰胺破壞了玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，使得內(nèi)部的色氨酸完全暴露，在堿性環(huán)境下發(fā)生了熒光猝滅。

圖5 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的內(nèi)源性熒光光譜Fig.5 Typical intrinsic emission fluorescence spectra of zein at different deamidation degree

2.6 紫外吸收

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光的吸收作用，根據(jù)蛋白質(zhì)對(duì)紫外光譜吸收的不同，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子在溶液中構(gòu)象的變化[26]。蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的吸收峰值在280 nm左右。由圖6可以看出，脫酰胺度低(DD=0.89%)時(shí)，玉米醇溶蛋白的最大紫外吸收峰大約在280 nm，脫酰胺度高(DD=34.70%)時(shí)，吸收強(qiáng)度增加，表明蛋白質(zhì)內(nèi)容發(fā)色基團(tuán)暴露在外部，玉米醇溶蛋白更加舒展[27]。紫外吸收強(qiáng)度的變化表明玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖6 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的紫外吸收光譜Fig.6 UV spectra of zein at different deamidation degree

2.7 分子柔性的變化

脫酰胺的過(guò)程是將玉米醇溶蛋白中的疏水的谷氨酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水的谷氨酸和天冬氨酸[28]。這種變化增加了玉米醇溶蛋白的親水特性，從而可用作食品加工的表面活性劑或乳化劑[9,28]。紫外吸收光譜的變化和內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化均說(shuō)明脫酰胺改變了玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，可能也改變了玉米醇溶蛋白分子的柔性。利用低脫酰胺度(DD=0.89%)和高脫酰胺度(DD=34.70%)的玉米醇溶蛋白對(duì)胰蛋白酶的敏感性表征分子柔性，見(jiàn)圖7。

圖7 脫酰胺度對(duì)玉米醇溶蛋白分子柔性的影響Fig.7 The effect of deamidation on the flexibility of zein

脫酰胺度為0.89%時(shí)，玉米醇溶蛋白經(jīng)過(guò)胰蛋白酶修飾后在280 nm下的吸光值為0.11，而脫酰胺度為34.70%時(shí)，玉米醇溶蛋白經(jīng)過(guò)胰蛋白酶修飾后在280 nm下的吸光值為0.54，說(shuō)明脫酰胺作用可以增加玉米醇溶蛋白的分子柔性。KATO等研究發(fā)現(xiàn)增加蛋白質(zhì)的柔性可以顯著改善蛋白質(zhì)的乳化性[18]。

3 結(jié)論

與50%～90%的乙醇-水溶液介質(zhì)相比較，玉米醇溶蛋白在水介質(zhì)中更容易發(fā)生脫酰胺作用。高脫酰胺度(DD=34.70%)玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性比低脫酰胺度(DD=0.89%)玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了244.86%和1 055.85%。脫酰胺作用改變了玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，提高了玉米醇溶蛋白分子的柔性，本研究的結(jié)果為開(kāi)發(fā)天然乳化劑提供了很好的基料并奠定了理論基礎(chǔ)。