張玥，薛雨菲，李芳，楊罡，戴志偉，劉偉，孔令明*，孫乾

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830021)3(福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建農(nóng)林大學(xué)中愛(ài)食品材料科學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)國(guó)際合作中心，福建 福州，350002)

核桃是果木兼用樹(shù)種，有著豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。中國(guó)核桃產(chǎn)量居世界首位，使得核桃成為開(kāi)發(fā)功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料。目前，核桃榨油后得到的副產(chǎn)物核桃餅粕的綜合利用率低，或用作肥料、飼料。核桃中蛋白質(zhì)含量為18%～25%，其中谷蛋白占總蛋白的70%以上。谷蛋白為水不溶性蛋白質(zhì)，且雙親性較差，因此，為有效利用核桃蛋白，擴(kuò)大其在食品加工及其他領(lǐng)域的應(yīng)用，從核桃餅粕中提取蛋白質(zhì)并綜合性利用加工成為核桃蛋白高值化應(yīng)用的主要加工方向。

糖基化(glycosylation)作為一種常用的、簡(jiǎn)潔有效的蛋白質(zhì)修飾方法，能高效地修飾蛋白質(zhì)特性。糖基化反應(yīng)的本質(zhì)是美拉德(Maillard)反應(yīng)中Amadori重排，即蛋白分子中的賴氨酸殘基與糖分子中的羥基共價(jià)鍵結(jié)合形成糖-蛋白類物質(zhì)。在蛋白質(zhì)分子中的氨基酸側(cè)鏈上引入糖類物質(zhì)的基團(tuán)，生成的蛋白-糖類物質(zhì)能夠在特定環(huán)境中阻礙蛋白分子相互聚集，提高蛋白質(zhì)的功能特性[1]。糖基化改性相比其他改性方法，因其快速化、強(qiáng)烈化、顯著化和高效化等特點(diǎn)，而逐漸成為現(xiàn)代食品加工領(lǐng)域熱點(diǎn)的研究方向之一。

目前，糖基化改性的研究多集中在大豆、花生、大米、乳清分離蛋白、酪蛋白等[2]，較為詳盡地闡述了影響改性蛋白的眾多因素，如溫度、時(shí)間和pH等。而且大量的研究也表明了糖基化的改性具有良好的效果，有研究表明[3]糖基化改性后大豆分離蛋白和葡萄糖復(fù)合物的溶解度、乳化特性均有顯著提高；即使在蛋白的等電點(diǎn)處，經(jīng)改性后的糖-蛋白復(fù)合物也具有良好的溶解性[4]；DECOURCELLE等[5]研究魚(yú)蝦蛋白與糖的反應(yīng)，得到糖-蛋白復(fù)合物的溶解性也有顯著提高；有研究[6]稱，酪蛋白與糖反應(yīng)，改善了糖-蛋白共價(jià)復(fù)合物的乳化效果，復(fù)合產(chǎn)物擁有了更優(yōu)良的功能特性；還有研究[7]稱，在糖基化改性中，選擇多糖比單糖與雙糖的效果更好，更有助于蛋白功能特性的提升。

實(shí)驗(yàn)選用葡萄糖、乳糖和葡聚糖修飾核桃谷蛋白，以接枝度、褐變度、溶解度、乳化特性、起泡特性等指標(biāo)為依據(jù)，并結(jié)合光譜圖分析核桃谷蛋白改性前后功能特性以及蛋白分子結(jié)構(gòu)表征的變化，為核桃蛋白的綜合性利用、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和高質(zhì)化精深加工提供理論參考，以期為核桃產(chǎn)業(yè)的深加工以及食品工業(yè)生產(chǎn)提供有利的支撐和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕(冷榨后含蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.29%)，新疆中亞食品有限公司；核桃谷蛋白(walnut glutenin，WG，純度為80.26%)，實(shí)驗(yàn)室自制；葡萄糖、乳糖，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖，Admas Reagent Co., Ltd.；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA )，上海高鳴化工有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、Ellman’s試劑，北京索來(lái)寶科技有限公司；2-巰基乙醇(分析純)，北京津同樂(lè)泰化工產(chǎn)品有限公司；KBr (光譜純)，天津市金貝爾科技有限公司；甘氨酸、碳酰二胺，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5-5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式數(shù)顯pH計(jì)(Testo205)，德圖儀表(深圳)有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-6)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；低速離心機(jī)(TDL-5-A)，上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810PC)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1-2)，德國(guó)Marin Christ公司；定時(shí)恒溫磁力攪拌器(MHY-16310)，北京美華儀科技有限公司；掃描電子顯微鏡(S-5500)，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 改性蛋白的制備

工藝流程：WG→制備溶液→攪拌→調(diào)pH→加糖(葡萄糖、乳糖和葡聚糖)→攪拌→調(diào)pH→恒溫反應(yīng)→糖-蛋白復(fù)合物→真空冷凍干燥→糖基化蛋白

稱取2.00 g WG分散于去離子水中(蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為60～80 g/L)，室溫下攪拌1 h，用1 mol/L NaOH調(diào)不同pH，分批加入單糖、雙糖和多糖，不斷攪拌，調(diào)溶液pH 7.0終止反應(yīng)。之后真空冷凍干燥處理，得到糖-蛋白接枝產(chǎn)物。葡萄糖改性蛋白(glucose modified protein，GMP)、乳糖改性蛋白(lactose modified protein，LMP)、葡聚糖改性蛋白(dextran modified protein，DMP)，對(duì)照樣品不添加糖類[1]。

1.3.2 溶解度的測(cè)定

根據(jù)HORAX等[8]方法稍作改動(dòng)。配制10 g/L的WG、GMP、LMP和DMP各10 mL，攪拌20～30 min，置于離心管中，離心(4 500 r/min，15 min)，取上清液。取空試管，加入考馬斯G-250、去離子水和上清液，振蕩1 min左右，靜置10 min后，波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定。對(duì)照組不加上清液。按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m0，樣品蛋白含量；m1，上清液蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 接枝度測(cè)定(鄰苯二甲醛)比色法

稱取50 mg OPA，分散在甲醛溶液中，加入SDS、2-巰基乙醇和硼砂溶液，充分混勻后定容，制得OPA溶液[9]。

測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確稱取4.00 mL OPA溶液，加入200 μL樣品，35 ℃水浴2 min后測(cè)定吸光值A(chǔ)340；同理，做空白對(duì)照組。接枝度按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A0,接枝反應(yīng)前溶液吸光度；A1,接枝反應(yīng)后溶液吸光度。

1.3.4 褐變程度的測(cè)定

1.3.5 持水性的測(cè)定

(3)

式中：m0，蛋白樣品質(zhì)量；m1，離心管與樣品總質(zhì)量；m2，離心管與沉淀物質(zhì)量。

1.3.6 持油性的測(cè)定

依照PEDROCHE等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取0.10 g的WG、GMP、LMP和DMP記為m0，置于離心管中稱量，記為m1，加入5 mL大豆油，振蕩1 min，3 300 r/min離心15 min，吸去殘留油脂，稱量離心管與樣品質(zhì)量記為m2。按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：m0，蛋白樣品質(zhì)量；m1，樣品與離心管總質(zhì)量；m2，吸油后樣品與離心管總質(zhì)量。

1.3.7 起泡及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

起泡性與泡沫穩(wěn)定性[13]：準(zhǔn)確稱取1.00 g的WG、GMP、LMP和DMP溶解于pH 7.0的磷酸緩沖溶液中，取10.0 mL置于25 mL離心管中測(cè)定其體積值記為V0，以10 000 r/min的速度均質(zhì)2 min；記錄均質(zhì)數(shù)據(jù)。分別按公式(5)、(6)計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性：

(5)

(6)

式中：V0，初始樣液體積；V1，均質(zhì)放置0 min后樣液總體積；V2，均質(zhì)放置30 min后樣液總體積。

1.3.8 熒光分光光度分析

將蛋白置于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，使蛋白質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。在狹縫5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)310 nm條件下進(jìn)行掃描測(cè)定[14]。

1.3.9 紫外分光光度分析

使用pH 7.0的PBS蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為0.1 mg/mL，在200～400 nm波長(zhǎng)下掃描測(cè)定[15]。

1.3.10 巰基與二硫鍵測(cè)定

游離巰基含量的測(cè)定：將30 mg樣品分散于Ellman’s試劑中，經(jīng)均質(zhì)和4 800 r/min離心15 min，在412 nm波長(zhǎng)處使用分光光度計(jì)測(cè)定[15]。

總巰基含量的測(cè)定：將30 mg樣品分散于10.0 mL混合試劑中(精確稱取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA和960.96 g碳酰二胺，加水定容至1 000 mL)中，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)量。巰基含量按公式(7)計(jì)算：

(7)

式中：A412，吸光度；n，稀釋倍數(shù)；m，上清液中蛋白質(zhì)含量。

NTSB 合成根據(jù)PETRUCCELLI等[16]的方法：稱取 1.0 g DTNB 溶解在 100 mL 1 mol/L 的 Na2SO3溶液中，調(diào)節(jié) pH 值到7.5。加入 0.5 mL 0.1 mol/L 的 CuSO4氨溶液，38 ℃下保溫。渦旋振蕩至溶液從亮紅色變?yōu)榈S色，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

NTSB 測(cè)試液：用 0.2 mol/L 的 Tris-base 緩沖液(10 mmol/L EDTA，0.1 mol/L Na2SO3和 3 mol/L異硫酸胍)將 NTSB 儲(chǔ)液稀釋 100 倍，調(diào)節(jié) pH 值到 9.5。

二硫鍵含量的測(cè)定：取50 mg蛋白樣品，置于Tris-base緩沖液，加入NTSB溶液，靜置1 h，離心(10 000 r/min 10 min)，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)量，對(duì)照樣品加入NTSB溶液。二硫鍵含量按公式(8)計(jì)算：

(8)

式中：SHT，總巰基含量；SHF，自由巰基含量。

1.3.11 圓二色光譜(circulat dichroism,CD)分析

將蛋白用pH 7.0的PBS稀釋為0.3 mg/mL，放置3 h。掃描波長(zhǎng)190～250 nm，掃描速率100 nm/min，測(cè)試溫度25 ℃[14]。重復(fù)8次掃描，取平均值。

1.3.12 掃描電子顯微鏡觀察

將WG和改性蛋白樣品固定于雙面導(dǎo)電膠上，樣品表面噴涂電鍍層，噴金厚度約10 nm，在20 kV電壓下進(jìn)行掃描，拍樣品圖[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用Excel 2003繪制圖表進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，光譜圖用儀器自帶系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接枝度與褐變度的測(cè)定

衡量糖基化反應(yīng)的指標(biāo)一般為接枝度與褐變度。接枝度與褐變度往往反映較為直觀地說(shuō)明糖基化反應(yīng)發(fā)生的進(jìn)程，接枝度反映美拉德反應(yīng)的初級(jí)程度,褐變度反映美拉德反應(yīng)的高級(jí)程度。糖基化實(shí)質(zhì)是游離氨基與羰基相互作用形成的共價(jià)化合物，新化合物的形成、接枝度的升高是游離氨基減少的主要原因[18]。TURAN等[19]在闡述這種反應(yīng)的高級(jí)階段時(shí)，也說(shuō)明了游離氨基與羰基之間的反應(yīng)會(huì)生成含氮類的棕色、褐色聚合物或共聚物。

由圖1可知，GMP的接枝度最大，其次是DMP，可能是由于分子質(zhì)量相對(duì)較小的糖具有更多的還原性羰基，數(shù)量相對(duì)較多的羰基更容易與蛋白分子發(fā)生反應(yīng)，處于蛋白分子外部的游離氨基可以更快地與糖分子相互接觸并產(chǎn)生作用，處于蛋白分子內(nèi)部的氨基會(huì)因外部氨基產(chǎn)生反應(yīng)后也隨之發(fā)生相應(yīng)變化，從而表明接枝度與糖類分子質(zhì)量有一定相關(guān)性。TER等[20]在研究中稱，蛋白分子中氨基所觸發(fā)的與糖的反應(yīng)性可以判定糖基化的反應(yīng)進(jìn)程。Maillard反應(yīng)會(huì)有終產(chǎn)物產(chǎn)生，褐變程度的高低順序依次為：LMP>GMP>DMP，說(shuō)明糖的構(gòu)型能影響糖基化反應(yīng)。乳糖和谷蛋白反應(yīng)體系產(chǎn)生了更多的糖基化產(chǎn)物，從而可以反映出LMP向著高級(jí)階段進(jìn)行，可能是由于反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了焦糖化反應(yīng)和產(chǎn)生了生色團(tuán)[19]。

圖1 糖基化改性的接枝度與褐變度Fig.1 Grafting degree and browning degree of glycosylation modification

2.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

通過(guò)表1中改性前后的數(shù)據(jù)對(duì)比，WG的溶解度為17.43%，而GMP、LMP與DMP的溶解度分別為：94.84%、59.62%和98.42%；WG的持水性和持油性分別為：4.27%和4.81%；GMP、LMP與DMP的溶解度與持水性明顯高于WG，而GMP、LMP與DMP的持油性比WG低，分別是WG的78.17%、80.87%和61.54%。這是因?yàn)榈鞍着c糖產(chǎn)生反應(yīng)，隨著接枝程度的逐漸增大，糖鏈不斷介入到蛋白分子中，為蛋白分子提供了充足的親水性羥基基團(tuán)，這種親水性基團(tuán)會(huì)在蛋白質(zhì)的表面形成水化膜，使得核桃谷蛋白的親水性有較為顯著的增加[21-22]。改性后蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性平均提高了27.50%與5.39%。

表1 改性前后理化特性的比較Table 1 Comparison of physical and chemical properties before and after modification

2.3 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)是由氨基酸通過(guò)肽鍵連接組合成的大分子類物質(zhì)，具有較大空間和結(jié)構(gòu)。因此這種組合方式使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)的大量基團(tuán)，如氨基、羧基和羥基等，在受到外界影響時(shí)會(huì)發(fā)生某些變化，進(jìn)而影響其功能特性[23]。蛋白的熒光光學(xué)性質(zhì)與發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境具有緊密聯(lián)系，熒光光譜圖顯示接枝反應(yīng)會(huì)使谷蛋白中存在一定量的色氨酸由于光激發(fā)產(chǎn)生的電子躍遷，造成微環(huán)境改變[24-25]。由圖2可知，在310 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，WG的熒光峰在428 nm波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)-糖接枝物的熒光峰在431 nm波長(zhǎng)處，比較發(fā)現(xiàn)，改性蛋白的吸收峰發(fā)生紅移，熒光強(qiáng)度都顯著降低，可能是改性使得發(fā)色團(tuán)暴露而發(fā)生熒光猝滅。

圖2 核桃谷蛋白與改性蛋白的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of WG and modified protein

此外，接枝物的熒光強(qiáng)度顯著低于WG對(duì)照組。GMP、LMP與DMP的糖基化改性，一是由于反應(yīng)所處的較高溫度，在較高溫度下，蛋白質(zhì)的構(gòu)象不穩(wěn)定，會(huì)引起蛋白中的色氨酸大量減少，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[26]；二是由于外界環(huán)境的改變，使蛋白質(zhì)由原本的折疊狀態(tài)逐漸展開(kāi)呈伸展?fàn)顟B(tài)，蛋白質(zhì)此時(shí)去折疊化，由順序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)化轉(zhuǎn)變。

2.4 紫外光譜分析

蛋白的表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)有重要作用，蛋白的紫外吸收特性主要基于蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的變化[27]。

由圖3所示，WG在284 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)最高紫外吸收峰，吸光度為0.47。而改性蛋白的紫外吸收高低順序依次為：GMP>DMP>LMP，接枝產(chǎn)物的吸收峰均出現(xiàn)在276～278 nm波長(zhǎng)處，吸收峰藍(lán)移，生色基團(tuán)外在微環(huán)境發(fā)生了改變[28]，使得肽鏈上具有紫外吸收的色氨酸、酪氨酸殘基表露出來(lái)，其所帶的雜環(huán)π→π*電子躍遷也是引發(fā)吸收峰向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)的關(guān)鍵因素之一[29]，300～400 nm波長(zhǎng)附近的紫外吸光度的波峰消失，變得平滑，可能是改性使核桃谷蛋白中結(jié)構(gòu)得到伸展，電子躍遷能量逐漸減小，導(dǎo)致紫外吸收減弱[30]。

圖3 核桃谷蛋白與改性蛋白的紫外光譜Fig.3 UV-visible spectroscopy of WG and modified protein

2.5 巰基與二硫鍵的測(cè)定

巰基與二硫鍵含量對(duì)于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用，二者之間的交換作用可使得蛋白分子間發(fā)生凝聚[28]。圖4對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3種改性蛋白的總巰基含量呈下降趨勢(shì)，可知糖基化處理使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，WG的巰基大部分游離在蛋白表面，而改性蛋白的巰基相對(duì)來(lái)說(shuō)，是包埋或嵌在分子內(nèi)部。與WG相比，二硫鍵含量高低順序依次為：LMP>DMP>GMP，說(shuō)明隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，接枝度高的DMP和GMP所含的二硫鍵是減少的。巰基和二硫鍵不僅可以維持蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還能改變某些功能特性[31]，這些化學(xué)鍵的斷裂、結(jié)合和重組，都可以使得蛋白質(zhì)的更高級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，同時(shí)，結(jié)構(gòu)的改變又會(huì)作用于蛋白質(zhì)的功能特性。

圖4 核桃谷蛋白與改性蛋白的巰基與二硫鍵含量Fig.4 —SH and disulfide bond of WG and modified protein注：組間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著

2.6 圓二色光譜分析

WG、GMP、LMP和DMP四種蛋白的主要構(gòu)成為β-折疊與無(wú)規(guī)則卷曲，僅存在少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)。α-螺旋結(jié)構(gòu)通常存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，高度有序穩(wěn)定，不易改變蛋白功能特性[32]。與α-螺旋相比，β-折疊與無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)會(huì)使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，蛋白的功能特性易被改變。KATO等[33]發(fā)現(xiàn)，蛋白分子的柔性越好，其乳化性能越好。

如表2所示，WG以β-折疊結(jié)構(gòu)為主，α-螺旋結(jié)構(gòu)占17.62%，是改性蛋白的1.41倍。經(jīng)糖基化改性的GMP、LMP和DMP，其α-螺旋結(jié)構(gòu)均呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，可能是蛋白質(zhì)和糖共價(jià)結(jié)合后，α-螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白結(jié)構(gòu)分子發(fā)生伸展。與對(duì)照組相比，改性處理使蛋白的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在整體上變化不明顯，但含量均增加了約1.06倍。說(shuō)明接枝反應(yīng)后的GMP、LMP和DMP在溶液中結(jié)構(gòu)向無(wú)序轉(zhuǎn)變，增加了蛋白的不規(guī)則性。

表2 核桃谷蛋白與改性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的對(duì)比分析 單位：%Table 2 Comparative analysis of secondary structure changes between WG and modified proteins

2.7 掃描電鏡對(duì)WG與改性蛋白的觀察

如圖5所示，未改性的WG顆粒大小不一，大多呈散落小顆粒圓球狀堆積結(jié)構(gòu)。經(jīng)糖基接枝反應(yīng)后的GMP、LMP與DMP所形成的是質(zhì)地十分緊密的較大塊狀結(jié)構(gòu)，且這種結(jié)構(gòu)的表面均表現(xiàn)出一定的光滑性，有較為明顯的棱角質(zhì)地感，且所形成的塊狀大小以及規(guī)模更加趨近于晶體化。

對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)核桃谷蛋白進(jìn)行改性處理后，大部分以片層或塊狀結(jié)構(gòu)存在，體積較大。這可能是因?yàn)閃G與糖基共價(jià)結(jié)合，分子間的疏水作用減弱，大分子物質(zhì)分散開(kāi)來(lái)，使得接枝物呈現(xiàn)展開(kāi)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有助于蛋白質(zhì)溶解性、水合能力的提升[34]。

a-WG(5 000×);b-GMP(5 000×);c-LMP(5 000×);d-DMP(5 000×);e-WG(10 000×);f-GMP(10 000×);g-LMP(10 000×);h-DMP(10 000×)圖5 核桃谷蛋白及其糖基化接枝物的SEM圖Fig.5 The SEM micrographs of WG and its glycosylation grafting

3 結(jié)論

經(jīng)糖基化改性，GMP、LMP與DMP接枝反應(yīng)較充分，溶解度與持水性均有較大幅度提高，但由于接枝物構(gòu)象限制，起泡特性變化較小，總體上變化并不明顯。結(jié)合熒光光譜圖分析，接枝產(chǎn)物的吸收峰發(fā)生變化，可知分子內(nèi)部的氨基酸基團(tuán)極性狀態(tài)發(fā)生了一定改變，使得蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變，且熒光強(qiáng)度及吸收強(qiáng)度也被影響，蛋白的親水性以及疏水性發(fā)生了變化。蛋白的游離巰基是決定親水性的主要原因，蛋白分子內(nèi)部以及分子間化學(xué)鍵變化，都可以引發(fā)蛋白相對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而結(jié)構(gòu)表征性變化又會(huì)影響到蛋白外在功能特性。掃描電子顯微鏡顯示，糖基化修飾會(huì)影響蛋白分子的微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)也有影響。圓二色光譜分析得出，接枝物的α-螺旋結(jié)構(gòu)有較為明顯的下降，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在整體上未發(fā)生顯著性變化，說(shuō)明糖基化修飾使得谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞。

在相關(guān)科學(xué)研究中，毛曉英課題組[35-37]在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氧化性修飾對(duì)核桃蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)难趸瘽舛扔欣谔岣吆颂业鞍椎娜榛钚院腿榛€(wěn)定性。孫乾等[25]采用?；c磷酸化對(duì)核桃谷蛋白進(jìn)行改性處理，發(fā)現(xiàn)蛋白的溶解度、持水性均得到提升，與本研究結(jié)果相似。化學(xué)法對(duì)谷蛋白的改性效果極為明顯，但可能會(huì)帶來(lái)蛋白的不可逆變性或有與蛋白結(jié)合緊密的殘存物質(zhì)。薛雨菲等[38]和張愛(ài)琴等[39]運(yùn)用復(fù)合蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性核桃谷蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解可使深藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部的親水性基團(tuán)逐漸暴露而改善蛋白質(zhì)的功能特性。酶法反應(yīng)溫和，但在功能特性的改變上并非有較大差異性，且會(huì)在蛋白質(zhì)酶解時(shí)產(chǎn)生苦味。糖基化修飾對(duì)蛋白的功能特性有較為顯著的改變，但研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)易受溫度、pH以及時(shí)間等因素影響，從而使改性后的蛋白有較濃重的色澤干擾，這直接影響了產(chǎn)品的感官特性[7]。在改性技術(shù)上，應(yīng)更可能地選擇物理、化學(xué)、酶法以及糖基化法等多技術(shù)方法聯(lián)用，規(guī)?；a(chǎn)具有安全性、穩(wěn)定性、高附加值的核桃蛋白。