蔣秋琪，呂雪芹,2，崔世修，劉延峰，堵國成，劉龍*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的非蛋白質(zhì)硫醇肽，廣泛存在于活性生物體中[1-2]。在大多數(shù)革蘭氏陰性細菌和真核細胞中，GSH的生物合成主要通過兩步ATP依賴的酶催化反應(yīng)完成：1)L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS，GSHI)的催化下消耗ATP產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸；2)隨后谷胱甘肽合成酶(GS，GSHⅡ)催化γ-谷氨酰半胱氨酸和L-甘氨酸產(chǎn)生GSH?；诠入赘孰闹匾纳砘钚?，例如抗氧化劑[3]、免疫增強劑[4]、氨基酸轉(zhuǎn)運[5]和排毒[6]等，GSH已被廣泛用于食品添加劑[7]、化妝品[8]和制藥行業(yè)[9]。

迄今為止，許多基因工程技術(shù)，例如過表達或失活GSH代謝途徑中的關(guān)鍵酶等，已用于高產(chǎn)GSH菌株的構(gòu)建[10]。FEI等將來自釀酒酵母gshⅠ和gshⅡ基因引入到畢赤酵母(Pichiapastoris)，重組酵母中GSH的產(chǎn)量達到4.15 g/L[11]。GE等將帶有雙功能GshF基因的載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，使其GSH產(chǎn)量提高了近80%[12]。據(jù)報道，HARA等過表達了硫酸鹽同化過程中的MET14和MET16基因，使釀酒酵母細胞內(nèi)GSH含量分別增加了1.2倍和1.4倍[13]。此外，其他策略包括GSH的跨膜轉(zhuǎn)運[14]，添加前體[15]和運用高壓空氣處理[16]等，也可提高GSH的產(chǎn)量。

本研究中，基于本實驗室保存的產(chǎn)GSH菌株(先前已構(gòu)建了表達釀酒酵母gshⅠ和gshⅡ基因的畢赤酵母GS115菌株)，致力于優(yōu)化其gshⅠ和gshⅡ基因的拷貝數(shù)，以進一步提高GSH的產(chǎn)量。同時，通過CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除GSH降解基因(dug1/dug2/dug3)，以減輕細胞內(nèi)的GSH分解代謝壓力。經(jīng)過改造，畢赤酵母中GSH的產(chǎn)量顯著增加，為未來GSH的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基

表1列出了本研究中使用的所有質(zhì)粒和菌株。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)JM109(美國Novagen)用于重組DNA實驗。畢赤酵母GS115(基因組整合釀酒酵母gsh+I和gsh+II基因的菌株)被用作表達GSH合成酶的親本菌株。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

在含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基(10.0 g/L胰蛋白，5.0 g/L酵母提取物和10.0 g/L NaCl)中培養(yǎng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。畢赤酵母在含有0.25 mg/mL G418或0.2 mg/mL潮霉素的YPD培養(yǎng)基(20.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L蛋白胨，10.0 g/L酵母提取物)中生長。

1.2 表達載體的構(gòu)建

1.2.1 表達gsh+I和gsh+II基因載體的構(gòu)建

分別用引物對F/R-GSH1和F/R-GSH2在畢赤酵母基因組上擴增出gsh+I和gsh+II基因，并用GAP啟動子和AOX終止子進行表達。同時，使用引物對(F/R-PICKA-gsh)通過PCR將載體pPICKA線性化。最后，通過Gibson組裝將5個片段(GSHI，GSHII，GAP1，GAP2，AOX2)連接到載體上(圖1-a)。

1.2.2 用于CRISPR/Cas9的質(zhì)粒和供體DNA的構(gòu)建

首先通過重疊延伸PCR將六個引物組裝成single guide RNA(sgRNA)。其次將純化后的sgRNA通過一步克隆法與CRISPR/Cas9質(zhì)粒相連，構(gòu)建出載體pCas9-sgRNA-dug3(圖1-c)。其中CRISPR/Cas9質(zhì)?？蓮腁ddgene獲得。

使用引物對F/R-UP-donorDNA-dug3和F/R-DOWN-donorDNA-dug3，從GS115基因組上擴增靶基因dug3的5′-上游和3′-下游區(qū)域各1 000 bp片段。上游片段的反向引物和下游片段的正向引物彼此共享30～40 bp序列，以此將2個純化的同源片段通過PCR融合在一起?；騞ug2與dug1的敲除方法同dug3。

a-5個片段連接到載體; b-6個引物重疊延伸構(gòu)建sgRNA;c-載體pCasq-sgRNA-dug3圖1 載體pPICKA-gsh12和pCas9-sgRNA-dug3的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmids pPICKA-gsh12 and pCas9-sgRNA-dug3

1.3 轉(zhuǎn)化與篩選

1.3.1 pPICKA-GSH12轉(zhuǎn)化和G418抗性菌株篩選

首先使用Thermo Scientific Fast Digest限制性內(nèi)切酶Pme+I將質(zhì)粒pPICKA-GSH12線性化，根據(jù)手冊(Invitrogen)通過電轉(zhuǎn)法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，涂布于含有0.25 mg/mL G418的YPD平板，于30 ℃下孵育2～3 d。選擇平板上長出的較大菌落，點涂在含有 2 mg/mL G418質(zhì)量濃度的YPD平板上。隨后繼續(xù)選擇較大菌落，依次點涂在G418濃度逐次上升的YPD平板上(質(zhì)量濃度梯度為5、10、20、25 mg/L)。最后，選擇18個較大菌落和5個較小菌落進行發(fā)酵驗證。

1.3.2 CRISPR-Cas9質(zhì)粒、供體DNA的共轉(zhuǎn)化與篩選

將0.5～1 μg環(huán)狀質(zhì)粒(pCas9-sgRNA-dug3)和5 μg線性供體通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，并在含有0.2 mg/mL潮霉素的YPD平板上生長2～3 d。從板中挑選出23個菌落，使用分別位于上下游同源片段上的引物對F/R-dug3，以原始菌株作為對照，驗證其是否包含正確整合的供體DNA盒。

1.4 搖瓶培養(yǎng)和GSH含量分析

在斜面培養(yǎng)基上挑取單菌落加入裝有20 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在30 ℃下培養(yǎng)24 h。然后將體積分數(shù)為10%的種子液加入到裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中。此時溫度、攪拌速度和培養(yǎng)時間分別為30 ℃、220 r/min和48 h。

從發(fā)酵液中提取GSH。1 mL發(fā)酵液離心后加入等量的5%稀硫酸，將混合物在沸水中煮1 min，以8 000×g的速度離心5 min，取上清液過濾待用。使用HPLC方法分析GSH的含量，流動相中甲醇和10 mmol/L 1-庚烷磺酸鈉、50 mmol/L KH2PO4緩沖液(pH 2.8)的比例為5∶95體積比，檢測溫度為30 ℃，流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm。

1.5 gsh+I和gsh+II基因拷貝數(shù)的定量分析

使用實時PCR測定gsh+I和gsh+II的相對拷貝數(shù)。首先，使用總RNA提取試劑盒(TIANGEN)從GS115和GS115-No.10中提取其總RNA。隨后，使用Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒(TAKARA)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于下一步檢測。以10-1～10-9為梯度稀釋純化的gsh+I基因，以其為模板建立標準曲線。使用引物F/R-gsh1-rtPCR，在Roche Light Cycle?480熒光定量PCR儀進行檢測，每個稀釋液重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束時，通過軟件分析獲得目標基因的標準曲線。

2 實驗結(jié)果

2.1 基于G418篩選具有高拷貝數(shù)的gsh+I和gsh+II基因的畢赤酵母

在外源插入釀酒酵母S288Cgsh+I和gsh+II基因的初始畢赤酵母GS115基礎(chǔ)上，將線性化的重組質(zhì)粒pPICKA-gsh12整合其上，這個過程是隨機多拷貝發(fā)生的。由于質(zhì)粒上的卡納抗性基因與表達盒具有遺傳連鎖，因此可從G418高抗性推斷該克隆所包含多拷貝的基因數(shù)。依次在含有不同質(zhì)量濃度G418(2、5、10、20、25 mg/L)的YPD平板上篩選后，選擇18個較大菌落和5個較小菌落進行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)測定，菌株GS115-No.10的最高搖瓶產(chǎn)量為1.6 g/L，比原始菌株GS115的產(chǎn)量高60%(圖2-a)。

通過測定對照菌株GS115和重組菌株GS115-No.10在種子培養(yǎng)和發(fā)酵時期的生長曲線可知，在種子培養(yǎng)階段，對照菌株比GS115-No.10提早進入穩(wěn)定期(圖2-c)。同樣地，在發(fā)酵階段，對照菌株比GS115-No.10早8小時進入穩(wěn)定期(圖2-d)。

將線性化的重組質(zhì)粒pPICKA-gsh12通過5’AOX1位點，同源重組到畢赤酵母的基因組上。提取對照菌株GS115和GS115-No.10菌株的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后通過RT-PCR確定這2個菌株中g(shù)sh+I基因的起始模板拷貝數(shù)。分析可知，經(jīng)過篩選實驗后，靶菌株與對照起始模板拷貝數(shù)的比率增加，GS115-No.10的拷貝數(shù)約為對照的5倍(圖2-b)。此外，在連續(xù)3輪培養(yǎng)后，GS115-No.10中GSH的生成無明顯變化，表明篩選出來的高拷貝菌株較穩(wěn)定。

2.2 敲除GSH降解基因dug1/2/3

我們通過敲除dug1，dug2和dug3基因來研究GS115-No.10菌株中GSH產(chǎn)量的變化。首先將質(zhì)粒pCas9-sgRNA-dug3和供體DNA-dug3共轉(zhuǎn)化到GS115-No.10菌株中。從含有潮霉素的YPD平板上挑選47個轉(zhuǎn)化體，使用F/R-dug3引物對，通過菌落PCR驗證。經(jīng)凝膠核酸電泳分析后，從轉(zhuǎn)化體擴增出1 031 bp和1 978 bp兩種條帶(圖3-c)。經(jīng)過測定1 031 bp PCR產(chǎn)物的序列可知，供體DNA-dug3序列已成功替換了原始dug3基因的1 978 bp片段。按照上述步驟分別敲除dug1和dug2基因，通過凝膠電泳分析獲得了818 bp(對照1 125 bp)和927 bp(對照2 016 bp)的條帶。最后，通過傳代培養(yǎng)除去游離質(zhì)粒pCas9-sgRNA。敲除dug3/dug2/dug1基因的菌株用于發(fā)酵驗證。如圖3-a和3-b所示，敲除dug3的菌株干細胞質(zhì)量為7.5 g/L，比對照低23.6%，而GSH的產(chǎn)量沒有明顯變化。結(jié)果表明，敲除dug基因使單位酵母體積中的GSH含量增加，但酵母的生長受到了影響。

a-對照和23個重組菌株的GSH產(chǎn)量;b-根據(jù)GS115-No.10和對照菌株的Ct值計算得出其對應(yīng)的拷貝數(shù)(log)分別為2.9和2.18;c-在種子培養(yǎng)時期對照和GS115-No.10菌株的生長曲線; d-在發(fā)酵時期對照和GS115-No.10菌株的生長曲線;1～18號為大菌落，19-23號為小菌落圖2 篩選具有g(shù)sh+I和gsh+II基因高拷貝的菌株Fig.2 Screening strains for high copy numbers of gsh+I and gsh+II genes

a-對照和敲除菌株的GSH產(chǎn)量; b-發(fā)酵44 h時對照和敲除菌株的OD600值; c-敲除dug1/2/3基因電泳圖; d-單位質(zhì)量細胞所含GSH的量圖3 敲除GSH分解代謝基因Fig.3 Knockout of GSH catabolic genes

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 葡萄糖濃度的優(yōu)化

由于單個基因缺失的菌株生長受到一定影響，我們優(yōu)化了培養(yǎng)基以增強細胞生長。鑒于葡萄糖是畢赤酵母培養(yǎng)基的一種碳源，首先優(yōu)化了其中的葡萄糖質(zhì)量濃度。如圖4所示，當初始葡萄糖添加量為60 g/L時，dug基因缺失菌株的GSH產(chǎn)量仍為1.6 g/L，但其細胞密度略有增加。在15～60 g/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中葡萄糖含量與GSH產(chǎn)量正相關(guān)。但是，超出此范圍，葡萄糖含量與GSH產(chǎn)量不成比例，圖4顯示，培養(yǎng)基中的葡萄糖越多，GSH的濃度越低。因此我們推斷造成酵母生長負面影響的原因可能是葡萄糖效應(yīng)。

圖4 葡萄糖添加量優(yōu)化后每組的GSH產(chǎn)量和相應(yīng)的OD600Fig.4 GSH production and corresponding OD600values of each group in the optimization of glucose addition amount

2.3.2 優(yōu)化添加3種前體

酵母中GSH的合成需要谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的參與。在本研究中，為了優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中這3種成分的添加量，進行了3因素3水平正交實驗以確定最佳的方案。根據(jù)正交設(shè)計的直觀分析，如表2所示，分別取各組最大的Ki值所對應(yīng)的添加量，確定最優(yōu)方案是谷氨酸添加量為81 mmol/L，甘氨酸27 mmol/L和半胱氨酸13.5 mmol/L，此時GSH搖瓶產(chǎn)量為1.7 g/L。通過方差分析發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸的F值介于F0.10和F0.05之間，說明在這3個因素中，半胱氨酸的添加量是影響GSH產(chǎn)量的主要因素，而谷氨酸的影響最小。隨著半胱氨酸濃度的增加，GSH的產(chǎn)量反而降低，這可能是由于過量添加半胱氨酸會影響細胞生長。

表2 三因素三水平實驗分析表Table 2 Three-factor three-level experimental analysis table

表2 方差法分析3種氨基酸的最佳添加量Table 2 Analysis of the optimal addition of three amino acids by variance method

3 討論

谷胱甘肽在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。谷胱甘肽合成途徑涉及2個酶(GshI和GshII)或一個雙功能酶(GshF)。外源基因的拷貝數(shù)是影響其在畢赤酵母中表達效率的重要因素之一。產(chǎn)物合成代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達量與產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定關(guān)系。由于GshI是谷胱甘肽合成途徑中的關(guān)鍵酶[18]，我們過表達了gsh+I基因以增加畢赤酵母中GSH的產(chǎn)量，但是谷胱甘肽的產(chǎn)量反而下降了。從液相色譜-質(zhì)譜法的結(jié)果中可知，與對照相比，過量表達gsh+I基因時的中間產(chǎn)物γ-GC積累更多(數(shù)據(jù)未顯示)。然后，我們在畢赤酵母GS115中同時過表達了gsh+I和gsh+II基因，并使用高濃度抗生素篩選出了具有高拷貝基因的宿主菌，使GSH的產(chǎn)量提高到1.6 g/L。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵一定時間后，細胞內(nèi)谷胱甘肽的含量有明顯的下降趨勢。由于谷胱甘肽參與細胞內(nèi)的硫酸鹽同化過程，因此推測當細胞內(nèi)谷胱甘肽過多時，其降解機制被激活以穩(wěn)定細胞硫代謝平衡[18]。在酵母中發(fā)現(xiàn)的包含3個基因dug1，dug2和dug3的GSH降解途徑(dug途徑)，被認為是GSH降解的主要途徑[19-20]。其中，dug1p功能亞基水解谷胱甘肽的一般肽鍵[21]，而dug2p和dug3p功能亞基參與γ-谷氨酰半胱氨酸和γ-肽鍵的水解[22]。BAUDOUIN等研究發(fā)現(xiàn)△dug2或△dug3突變酵母中GSH的降解幾乎被完全阻止，這表明dug2和dug3基因是該過程必不可少的[20]。

通過DNA序列BLAST發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母中dug基因在畢赤酵母中的同源基因，其蛋白質(zhì)序列同一性約為64%，表明畢赤酵母中的這個同源蛋白很可能發(fā)揮著相似的作用。因此，我們敲除此同源蛋白的對應(yīng)基因序列。

在這項研究中，我們通過篩選具有高拷貝gsh+I和gsh+II基因的畢赤酵母，并分別敲除在谷胱甘肽降解途徑中的3個基因(dug1/2/3)，最后經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化，將畢赤酵母中GSH的產(chǎn)量提高到1.7 g/L。該研究為實現(xiàn)更經(jīng)濟的谷胱甘肽工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。