唐源淋 陳 燁

深圳市第三人民醫(yī)院消化內科1(518114) 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科 廣東省胃腸疾病重點實驗室2

背景：肝硬化發(fā)病率在我國逐年上升，尤其是失代償期肝硬化及其相關并發(fā)癥嚴重威脅國人健康。目的：研究肝硬化患者的腸道菌群改變及其與病情嚴重程度和預后的關系。方法：納入2010年12月—2011年7月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院收治的肝硬化患者100例和50名健康人，提取糞便標本基因組DNA，采用菌屬特異性引物行real-time PCR定量檢測，分析腸道菌群改變與肝功能分級、預后評分、炎癥指標以及肝硬化并發(fā)癥的相關性。結果：與對照組相比，肝硬化組糞便中腸桿菌屬數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量顯著減少(P均<0.05)。腸桿菌屬數(shù)量與肝功能分級、Child-Turcotte-Pugh(CTP)評分、終末期肝病模型(MELD)評分、C反應蛋白(CRP)和自發(fā)性腹膜炎呈顯著正相關(P均<0.05)，梭菌屬則與上述指標呈顯著負相關(P均<0.05)。結論：在肝硬化患者中，腸道菌群失衡(腸桿菌屬數(shù)量增加、梭菌屬數(shù)量減少)與病情嚴重程度和預后有一定相關性。菌群失衡可能通過促進炎癥反應參與肝硬化進展。

肝硬化是我國常見病，發(fā)病率逐年上升，尤其是失代償期肝硬化及其相關并發(fā)癥嚴重威脅國人健康。失代償期肝硬化患者常死于感染、上消化道出血、肝性腦病等并發(fā)癥。在人體與微生物的交互作用中，腸-肝軸居關鍵地位[1]。動物實驗顯示，腸道菌群失衡在大鼠肝硬化模型并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2-3]。目前關于肝硬化患者腸道菌群的臨床研究較少，對發(fā)生紊亂的菌群及其對患者預后的影響尚不明確。本研究以健康人作為對照，分析肝硬化患者的腸道菌群改變及其與病情嚴重程度和預后的關系。

材料與方法

一、研究對象

研究納入2010年12月—2011年7月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科和感染內科收治的肝硬化患者100例，入選者均為肝炎后肝硬化，男性88例，女性12例，平均年齡(52±13)歲；肝功能Child-Pugh分級A級50例，B級31例，C級19例。納入標準：①經臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)學和影像學檢查確診，符合肝硬化診斷標準；②病歷資料完整。排除標準：①合并嚴重心、腦、肺、腎等器官功能不全(不包括肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝性腦病)；②合并功能性消化不良、慢性腹瀉、炎癥性腸病等已知可引起腸道菌群紊亂的胃腸道疾?。虎塾形改c道手術史。50例對照者為同期南方醫(yī)院體檢中心經常規(guī)檢查無異常發(fā)現(xiàn)的健康成人，男性36例，女性14例，平均年齡(53±12)歲。兩組間性別構成、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、方法

1. 標本采集：標本采集前4周內所有受檢者均未使用抗菌藥物和微生態(tài)制劑。于排便后2 h內將糞便標本收集于密閉的糞便儲存盒內。外周血標本5 mL收集于促凝采血管中，平衡后室溫離心3 500 r/min×5 min，血清分離后分裝。上述標本迅速儲存于-80 ℃低溫冰箱中。

2. 糞便基因組DNA提?。菏褂肨IANamp糞便DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。每例受檢者稱取20 mg糞便樣本，按試劑盒說明書提取基因組DNA，-20 ℃保存。

3. PCR引物設計：根據(jù)文獻報道設計腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬的菌屬特異性引物[4-5]，使用BLAST數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對引物序列特異性(表1)。

4. PCR引物特異性檢測：提取健康成人糞便基因組DNA進行PCR擴增。反應體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(溫度見表1)，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產物凝膠電泳分析未見明顯非特異性擴增，提示各菌屬引物特異性良好。

表1 菌屬特異性PCR引物

5. Real-time PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的real-time PCR試劑盒。將質粒標準品連續(xù)10倍稀釋，獲得10～107系列拷貝數(shù)標準品，以之為模板構建標準曲線。反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(腸桿菌屬58 ℃，腸球菌屬52 ℃，乳酸桿菌屬58 ℃，擬桿菌屬60 ℃，梭菌屬60 ℃)，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)。反應結束后分析熔解曲線。將待測糞便DNA適當稀釋，反應體系和反應條件同上，行real-time PCR擴增。檢測重復3次，結果取均值。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis H檢驗；率的比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關系數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、肝硬化患者腸道菌群改變

與對照組相比，肝硬化組糞便中腸桿菌屬數(shù)量增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，腸球菌屬數(shù)量無明顯變化(P>0.05；表2)。將腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量高于對照組中位值和乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量低于對照組中位值定義為腸道菌群異常，肝硬化組腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬正常與異常者的比例分別為28/72、60/40、33/67、25/75和27/73，其中腸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬異常者占比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006;P=0.007;P=0.003)。

表2 肝硬化組與對照組腸道菌群比較[M(P25, P75), lg copies/g濕糞]

二、腸道菌群與肝硬化嚴重程度和預后的關系

除乳酸桿菌屬外，其余四種菌屬在不同肝功能分級肝硬化患者中的數(shù)量分布差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05；表3)。相關性分析顯示，腸桿菌屬數(shù)量與Child-Pugh分級、Child-Turcotte-Pugh(CTP)評分、終末期肝病模型(MELD)評分和血清C反應蛋白(CRP)水平呈顯著正相關(P=0.022;P=0.044;P=0.043;P=0.021)；腸球菌屬與前三個指標呈顯著正相關(P=0.012;P=0.005;P=0.017)；梭菌屬與四個指標均呈顯著負相關(P<0.001;P<0.001;P=0.007;P=0.003)；擬桿菌屬只與Child-Pugh分級呈顯著負相關(P=0.011)；乳酸桿菌屬與四個指標均無相關性(P>0.05；表4)。

表3 不同肝功能分級肝硬化患者腸道菌群比較[M(P25, P75), lg copies/g濕糞]

表4 腸道菌群與肝硬化嚴重程度和預后的關系(秩相關系數(shù)rs)

三、腸道菌群與肝硬化并發(fā)癥的關系

相關性分析顯示，肝硬化并發(fā)癥與腸道菌群失衡之間有一定關聯(lián)，腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量與自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生呈顯著正相關(P<0.05)，梭菌屬數(shù)量則與之呈負相關(P<0.05)；腸球菌屬數(shù)量與腹水發(fā)生呈顯著正相關(P<0.05)；乳酸桿菌屬、擬桿菌屬數(shù)量與肝硬化并發(fā)癥無相關性(P>0.05；表5)。

表5 腸道菌群與肝硬化并發(fā)癥的關系

討 論

人體腸道內有近1014個微生物，分屬于500～1 000個不同種類[6]，包括細菌、真菌、病毒等。腸道細菌包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，以厭氧菌為主，主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門等，前兩種菌門占腸道細菌總量的70%以上，是腸道微生物的重要組成部分。在腸道微生物與宿主相互適應的過程中，微生物、宿主與腸道微環(huán)境之間達到一種平衡，此種平衡狀態(tài)對人體生理活動和健康發(fā)揮至關重要的作用。腸道內、外環(huán)境的改變導致優(yōu)勢菌群減少，進而引起腸道菌群失衡/紊亂，過路菌或條件致病菌數(shù)量超出正常水平致疾病發(fā)生。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)肥胖[7]、炎癥性腸病[8]、腸易激綜合征[9]、2型糖尿病[10]、代謝綜合征[11]、非酒精性脂肪性肝病[3,12]等多種疾病與腸道菌群失衡有關，且不斷有證據(jù)表明腸道菌群在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]。

本研究應用real-time PCR技術定量檢測肝硬化患者的糞便菌群改變，結果提示患者存在不同程度的腸道菌群失衡，表現(xiàn)為腸桿菌屬數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量顯著減少，腸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬菌群異常者占比顯著增高。腸桿菌屬數(shù)量隨肝功能的惡化而逐步增加，并與提示預后的MELD評分、炎癥指標CRP以及肝硬化并發(fā)癥自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生呈顯著正相關；擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量則隨肝功能的惡化而減少，其中梭菌屬與MELD評分、CRP和自發(fā)性腹膜炎呈顯著負相關。上述發(fā)現(xiàn)提示肝硬化患者的腸道菌群失衡，尤其是腸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬的變化與肝硬化病情和預后之間有密切聯(lián)系，臨床上應予充分重視。國、內外其他關于腸道菌群與肝硬化的研究亦得出與本研究大致或部分相符的結果[13-16]，如鐘轉華[15]的研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的腸道菌群失衡表現(xiàn)為雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益厭氧菌減少，腸桿菌、葡萄球菌、梭菌增加，且上述菌群變化可隨肝功能好轉而恢復；Chen等[14]和Kakiyama等[16]也報道了肝硬化患者腸道中條件致病菌腸桿菌顯著增加。Lata等[17]的隨機對照試驗中，肝硬化患者的基線腸道菌群失衡嚴重程度與肝硬化病因無關, 而與肝功能分級相關。這些研究結果均表明腸道菌群失衡與肝硬化患者的病情嚴重程度和預后有密切聯(lián)系，可加速疾病進展。

本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者腸道梭菌屬數(shù)量顯著減少，且與病情和預后呈負相關。Qin等[13]的宏基因組學研究也證實了這一變化，但亦有肝硬化患者腸道梭菌數(shù)量增加的報道[15]。梭菌屬是腸道內的優(yōu)勢厭氧菌，包含梭桿菌、梭球菌、艱難梭菌等眾多細菌。其中艱難梭菌是一種可致偽膜性腸炎的致病菌，梭桿菌則可酵解結腸中不消化的碳水化合物，產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)[18]。SCFAs不僅能為結腸細胞供能，而且對維持腸道細胞的完整性以及分泌和免疫功能具有重要意義，可加強腸黏膜屏障功能。本研究結果提示腸道梭菌屬對肝硬化患者有一定保護作用，梭菌屬中可能存在一些有益菌種，但尚需進一步研究驗證。

目前研究認為腸道微環(huán)境改變是肝硬化患者發(fā)生腸道菌群失衡的機制之一。肝硬化時腸道黏膜充血水腫，營養(yǎng)狀況差，菌群營養(yǎng)底物缺乏；次級膽汁酸和分泌型IgA(sIgA)減少，膽汁中含有可抑制腸道細菌過度生長的多種抗體和非特異性抗黏附素成分，并能中和細菌內毒素，因此肝硬化時腸腔內膽汁減少不利于腸道菌群的平衡[16]；腸蠕動減慢，清除能力降低，導致腸道細菌過度生長[19]。上述因素使維持腸道微生態(tài)平衡的宿主因素受到破壞，最終導致菌群失衡。腸道菌群失衡后，革蘭陰性桿菌產生大量內毒素，通過損傷的腸屏障進入體循環(huán)，形成內毒素血癥，激活肝臟Kupffer細胞，釋放大量促炎細胞因子如白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，使肝損害持續(xù)，進一步惡化肝功能，嚴重影響患者預后[20]。CRP是反映機體炎癥狀態(tài)的重要指標，本研究分析顯示肝硬化患者的腸桿菌屬和梭菌屬數(shù)量與血清CRP水平顯著相關，進一步提示了菌群失衡可能通過促進炎癥反應在肝硬化進展過程中發(fā)揮作用。

綜上所述，腸道菌群失衡在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與病情嚴重程度和預后有一定相關性。患者出現(xiàn)腸道菌群紊亂、腸黏膜通透性增加，提示肝損傷嚴重，預后可能較差。因此，在臨床工作中，檢測肝硬化患者的腸道菌群和腸黏膜通透性對病情評估和改善預后具有重要意義。尤其值得關注的腸道菌群包括腸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬，對上述菌群進行更深入的研究，可能為研發(fā)新的益生菌制劑提供理論依據(jù)。微生態(tài)制劑干預是阻斷肝硬化腸道菌群失衡的關鍵，但相關制劑種類繁多，目前研究未能提供充分的循證醫(yī)學證據(jù)支持何種益生菌制劑更有效及其臨床使用的適宜周期，需擴大樣本量、延長隨訪時間作進一步研究。不同種類的微生態(tài)制劑作用機制不同，不同病因肝硬化治療過程中益生菌的選擇亦不確定，因此微生態(tài)制劑菌種的篩選亟待加強。這一工作需要更細致的菌群分析結果，這也對肝硬化患者腸道菌群的定量分析提出了更高的要求，是未來腸道微生態(tài)研究的重要方向之一。