唐月陽 易紅 李星枝 龍漢安 王艦梅

1四川大學華西口腔醫(yī)院病理科（成都610041）；西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2細胞室，3病理科（四川瀘州646000）

結(jié)直腸癌是目前全球最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居第2 位，呈現(xiàn)逐年上升的趨勢［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌發(fā)病原因與不良生活方式、飲食習慣、腸道菌群紊亂、大腸腺瘤及遺傳因素等各方面關系密切［2］。其中約85%的結(jié)直腸癌是由結(jié)直腸癌息肉中的腺瘤逐步演變而來［3］。手術切除仍是目前治療結(jié)直腸癌的主要方式，術后輔以放化療，使結(jié)直腸癌治療取得較明顯的進步，但患者長期生存情況仍然較差［4］。因此，探討結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機制，篩選早期生物標志物，尋找新的治療靶點，對臨床診斷及治療結(jié)直腸癌都顯得格外重要。

F-box 蛋白7（F-box protein 7，F(xiàn)BXO7）是新發(fā)現(xiàn)的F-box 蛋白家族成員之一，F(xiàn)-box 是由40 個氨基酸殘基組成的一個特征性的酸性結(jié)構(gòu)域［5-6］。F-box 家族參與組成SKP1-CUL1-F-box（SCF）復合物，是泛素化系統(tǒng)的重要組成部分［7］。目前國內(nèi)外學者對于FBXO7 的研究不多，并且主要都集中在帕金森病方面，在腫瘤領域中的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO7 在肺鱗狀細胞癌和結(jié)直腸腺癌組織中過表達，提示FBXO7 很可能在肺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色［8］。同時FBXO7 也參與了細胞周期控制，調(diào)控相關生物因子并被認為是一種原癌基因［9］。本實驗檢測FBXO7 在結(jié)直腸癌細胞中的表達情況，并成功構(gòu)建GV230-FBXO7 表達載體，檢測其過表達對結(jié)直腸癌細胞生物學行為影響，初步探討FBXO7 調(diào)控結(jié)直腸癌細胞增殖、周期及遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細胞株均為病理科實驗室保存提供；引物均由上海生工生物工程公司合成；大腸桿菌感受態(tài)細胞、GV230 質(zhì)粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；DNA 電泳凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量取試劑盒、瓊脂糖粉均購于天根生化公司；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMII 和DNA Marker、T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoI 和KpnI 均購自日本Takara 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000 購自美國Invitrogen 公司；細胞周期檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；Enhanced Cell Counting Kit-8（增強型CCK-8試劑盒）購自碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 人結(jié)直腸癌細胞總RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄取出培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞的培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基，用預冷的PBS 沖洗2 ～3 遍，緩慢加入1 mL RNAiso Plus 后冰上靜置5 ～10 min。具體按照說明書提取總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度，OD260/OD280比值在1.7 ～2.2 為佳，放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑誘akara 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR 檢測FBXO7 的mRNA 的表達提取結(jié)直腸癌細胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過SYBR?Premix Ex TaqTMII 方法進行熒光定量PCR 檢測，從而在轉(zhuǎn)錄水平檢測FBXO7 的表達。用于熒光定量PCR 的FBXO7 引物如下：上游引物，5′-TGCTCTGTAGTGAATCGGTGGA-3′；下游引物，5′-CTTCGGTGCCCTGAGGTATG-3′；以GADPH做內(nèi)參，引物如下：上游引物，5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′ ；下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.2.3 引物設計合成與目的基因的擴增根據(jù)GV230 酶切位點，設計FBXO7 的擴增引物：分別選取FBXO7 基因編碼區(qū)雙側(cè)序列，分別加入XhoI 和KpnI 內(nèi)切酶酶切位點和保護堿基，上游引物5′-TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGAGGCTGCGGGTGCGGCTTC-3′；下游引物5′-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCATGAATGACAG CCGGCCATCAG-3′。取上述cDNA 為模板，加入FBXO7 前后引物根據(jù)說明書進行PCR 擴增。擴增條件：98 ℃預變性5 min →98 ℃變性10 s →55 ℃退火10 s →72 ℃延伸90 s →（共30 個循環(huán)）→再延伸8 min，產(chǎn)物放-20 ℃冰箱保存，將PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 FBXO7 載體構(gòu)建取PCR 擴增的FBXO7序列用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒說明小提質(zhì)粒GV230 質(zhì)粒，并經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物。于16 ℃循環(huán)水浴鍋中將上述制備純化的FBXO7 序列與線性化雙粘性末端的GV230 載體片段按比例用T4 DNA 連接酶置連接反應過夜，60 ℃滅活連接產(chǎn)物10min 后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落，接入LB 培養(yǎng)基中，根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒，從菌液中提取重組質(zhì)粒GV230 - FBXO7 并進行雙酶切鑒定和質(zhì)粒測序。

1.2.5 Western blot 法取轉(zhuǎn)染后72 h生長良好的結(jié)直腸癌細胞，提取總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，蛋白液中加入5×loading buffer，水浴鍋中煮沸至100 ℃，使蛋白完全變性，置于-20 ℃保存。每孔蛋白上樣量7 ～15 μL，10%SDS-PAGE 電泳分離在電壓80 ～110 V下進行，再以200 mA，90 min的恒流條件轉(zhuǎn)至甲醇預處理的PVDF 膜上，PBST配制的5%脫脂奶粉中封閉1 h 后，PBST 洗滌3 次，每次10 min，將PVDF 膜放入稀釋后的FBXO7 和GADPH抗體中，4 ℃搖床孵育過夜。次日，PBST 洗滌3 次，每次10 min 后，加入提前稀釋好的二抗中，繼續(xù)室溫搖床振蕩孵育1 h。最后PBST 洗滌3 次，每次6 min，再加入現(xiàn)配發(fā)光液，置于凝膠成像儀上發(fā)光。

1.2.6 細胞增殖實驗將轉(zhuǎn)染后48 h 的結(jié)直腸癌細胞，用胰酶消化離心并計數(shù)，以每孔100 μL 細胞懸液（2 000 個/孔）接種到96 孔板中。96 孔板邊緣每孔加入100 μL PBS，以防止蒸發(fā)影響實驗結(jié)果。分別培養(yǎng)6（當做0 h）、24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置于37 ℃孵箱中孵育1 h，酶標儀測定波長450 nm 處每孔的OD值。

1.2.7 流式細胞技術檢測細胞周期轉(zhuǎn)染后48 h的結(jié)直腸癌細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，1 000 r/min 離心3 min 后棄去上清，加入預冷的PBS 洗滌細胞沉淀，再次1 000 r/min 離心3 min 后棄去上清，加入預冷的70%乙醇，吹散細胞，4 ℃冰箱固定24 h。染色前用預冷的PBS 洗滌，加入500 μL Propidium Iodide 溶液，37 ℃避光孵育30 min。上機檢測，分析結(jié)果。

1.2.8 細胞劃痕實驗在6 孔板的背面，用Marker筆每隔0.5 ～1 cm 均勻地劃橫線，在每孔中加入5× 105個轉(zhuǎn)染24 h 后的細胞，培養(yǎng)過夜后使其能鋪滿。第2 天垂直于6 孔板背后的橫線，用10 μL 的槍頭劃痕。PBS 清洗細胞3 遍，洗去劃落的細胞后，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24、48 h 取樣拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法運用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用均數(shù)±標準差表示，t檢驗用于比較兩組間均數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXO7 在結(jié)直腸癌細胞中的表達情況通過實時熒光定量PCR 和蛋白免疫印跡檢測結(jié)直腸癌細胞中FBXO7 的mRNA 和蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT116 和SW620 細胞株中FBXO7 的mRNA（P ＜0.05）和蛋白表達量均明顯低于其他細胞株（圖1）。因此選用這兩株細胞進行后續(xù)相關實驗。

圖1 熒光定量PCR 和Western blot 法檢測結(jié)直腸癌細胞株中FBXO7 表達情況Fig.1 Detection of FBXO7 expression in colorectal cancer cell lines by real-time quantitative PCR and Western blot

2.2 目的基因片段獲取提取結(jié)直腸癌細胞中RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，以此為模板進行PCR 擴增。對該擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳顯示，在DNA Marker 的1 000 ～2 500 bp 范圍內(nèi)有一條明顯的條帶（圖2）。本實驗預擴增的FBXO7 全長大小為1 615 bp，該條帶大小與預期的條帶大小相符合，證明FBXO7 片段擴增成功。

圖2 PCR 擴增FBXO7 片段瓊脂糖電泳結(jié)果圖Fig.2 PCR amplification of FBXO7 fragment agarose electrophoresis results

2.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果對FBXO7 片段和質(zhì)粒GV230 分別進行限制性內(nèi)切酶XhoI 和KpnI 雙酶切后連接。將該產(chǎn)物進行細菌轉(zhuǎn)化，涂板、挑取單個菌落。搖菌并進行質(zhì)粒小提。經(jīng)雙酶切后電泳酶切產(chǎn)物，4.7 kb 和1 000 ～2 500 bp 左右分別出現(xiàn)條帶（圖3）。為進一步鑒定質(zhì)粒，送檢該質(zhì)粒測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，序列完全正確，從而證明重組質(zhì)粒GV230-FBXO7構(gòu)建成功。

圖3 GV230-FBXO7 雙酶切電泳結(jié)果圖Fig.3 Results of GV230-FBXO7 double digestion electrophoresis

2.4 轉(zhuǎn)染GV230-FBXO7 后檢測FBXO7 的表達情況將GV230 和GV230 - FBXO7 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞HCT116 和SW620，檢測結(jié)直腸癌細胞中FBXO7 的mRNA 和蛋白表達水平。實時熒光定量PCR 和蛋白免疫印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩株細 胞 中，GV230-FBXO7 組FBXO7 的mRNA（P ＜0.05）和蛋白表達量均明顯高于GV230 組（圖4）。該結(jié)果證明，GV230-FBXO7 在HCT116 和SW620中均成功過表達。

圖4 熒光定量PCR 和Western blot 法檢測GV230-FBXO7轉(zhuǎn)染效率Fig.4 Detection of GV230-FBXO7 transfection efficiency by real-time PCR and Western blot

2.5 FBXO7 過表達對結(jié)直腸癌細胞體外增殖的影響CCK-8 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與瞬時轉(zhuǎn)染的GV230組相比，GV230 - FBXO7組的HCT116 和SW620 細胞在不同時間段OD值均增加（圖5），并且差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。該結(jié)果表明，F(xiàn)BXO7 可以增強結(jié)直腸癌細胞的體外增殖能力。

2.6 FBXO7 過表達對結(jié)直腸癌細胞周期的影響利用流式細胞儀檢測過表達FBXO7 的HCT116 和SW620 細胞周期的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GV230 組相比，GV230 - FBXO7 組細胞的G1 期比例減少，而S 期比例增加（圖6），并且差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。由此可見，F(xiàn)BXO7 可以促進結(jié)直腸癌細胞由G1 期進入到S 期，促進細胞發(fā)生G1/S 期轉(zhuǎn)變。

圖5 GV230-FBXO7 過表達對結(jié)直腸癌細胞HCT116 和SW620 增殖影響Fig.5 Effect of GV230-FBXO7 overexpression on proliferation of rectal cancer cells HCT116 and SW620

2.7 FBXO7 過表達對結(jié)直腸癌細胞體外遷移能力的影響通過劃痕實驗檢測過表達FBXO7 后HCT116 和SW620 遷移能力變化，結(jié)果顯示，與GV230 組 相 比，GV230-FBXO7 組 的HCT116 和SW620 細胞遷移能力增強，表明過表達FBXO7 后增強了結(jié)直腸癌細胞的遷移能力（圖7）。

3 討論

F-box 蛋白家族是泛素化系統(tǒng)的重要組成部分，而F-box 結(jié)構(gòu)域是該家族的標志性結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)-box 蛋白通過參與泛素-蛋白酶體途徑進而調(diào)控細胞周期、轉(zhuǎn)錄、信號通路傳導等過程［10-11］。FBOX7 屬于新發(fā)現(xiàn)的F-box 蛋白家族的FBXO 類別［12］。研究顯示FBXO7 參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。FBXO7 突變可以使線粒體功能障礙，這與早發(fā)帕金森綜合征密切相關［13］，F(xiàn)BXO7 的丟失會通過RPL23-MDM2-TP53 途徑能導致帕金森氏樣多巴胺變性［14］。FBXO7 和α-突觸素G51D 同時突變可以導致特殊的臨床癥狀，被稱為帕金森-錐體束征［15］。此外，通過依賴p53 的方式，F(xiàn)BXO7 可以負向調(diào)節(jié)原代造血干細胞（primary hematopietic stem cells，HSPC）的增殖和分化，而當不存在p53 的情況下，F(xiàn)BXO7 表達可促進T 細胞淋巴瘤形成［9，16-17］。此外還有研究發(fā)現(xiàn)FBXO7在上皮腫瘤中高表達，在正常組織中不表達或低表達，因此FBXO7 可能具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用［18］。

圖6 GV230-FBXO7 對細胞周期的影響Fig.6 Effect of GV230-FBXO7 on cell cycle

圖7 GV230-FBXO7 對細胞遷移能力的影響Fig.7 Effect of GV230-FBXO7 on cell migration ability

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個極其復雜的過程，包括體內(nèi)微環(huán)境和細胞的多種遺傳改變［19］。而細胞增殖是所有生物體最重要生理特征之一，也是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎。在一些致癌因素誘導下，細胞增殖失去調(diào)控，可導致細胞無限增殖，從而形成腫瘤。因此調(diào)控癌細胞的增殖是影響癌癥發(fā)生和發(fā)展的關鍵。目前，還未有關于FBXO7 參與結(jié)直腸癌細胞增殖的相關文獻報道。本實驗中GV230-FBXO7 質(zhì)粒被成功構(gòu)建，并驗證了在結(jié)直腸癌細胞中的轉(zhuǎn)染效率。CCK-8 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達FBXO7 后可促進結(jié)直腸癌細胞體外的增殖。正常細胞周期以有序的方式進行，當調(diào)節(jié)細胞周期的基因發(fā)生突變、缺失和擴增時，細胞周期失去控制，細胞將無限增殖形成腫瘤。為進一步探究FBXO7 在細胞周期中的作用，本實驗通過過表達FBXO7 檢測其對結(jié)直腸癌周期的影響，發(fā)現(xiàn)G1 期細胞比例減少，而S 期細胞比例增加，表明FBXO7 可以促進結(jié)直腸癌細胞由G1 期進入到S期，促進細胞發(fā)生G1/S 期轉(zhuǎn)變，從而影響細胞的增殖能力。文獻報道FBXO7 可以特異性調(diào)節(jié)Cyclin D1/CDK6 復合物，其過表達能增加Cyclin D1/CDK6復合物和E2F 活性［18］。而細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4 或CDK6 都可以與Cyclin D1 相互作用形成復合物，促進G1 期至S 期的進展［20］，本實驗結(jié)果與其較一致。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的最主要的特征。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移取決于其逃離原發(fā)腫瘤的能力，通過滲入血管內(nèi)循環(huán)，滲入遠處組織并定植，同時逃避免疫監(jiān)視并促進局部組織環(huán)境變化［21］。腫瘤細胞以不同的模式滲入鄰近的組織基質(zhì)，如作為單個細胞傳播，稱為“個體細胞遷移”或成片細胞傳播，稱為“集體遷移”［22］。而惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的最重要標志是突破基膜。MMP-2 和MMP-9屬于MMP 家族，是一種可降解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，其異常表達在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［23］。有文獻報道，F(xiàn)-box 家族中的FBXO22可以增強結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移能力，其作用是通過MMP-2 和MMP-9 實現(xiàn)［24-25］。本實驗在結(jié)直腸癌細胞中過表達FBXO7。經(jīng)細胞劃痕實驗初步發(fā)現(xiàn)，過表達FBXO7 后明顯增強了結(jié)直腸癌細胞體外遷移能力，具體分子機制有待進一步探討。

綜上所述，F(xiàn)BXO7 不僅可以促進結(jié)直腸癌增殖，還能影響結(jié)直腸癌細胞周期以及增強結(jié)直腸癌細胞體外遷移能力。FBXO7 可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的不同階段均發(fā)揮著作用，促進結(jié)直腸癌的演進。本實驗為深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展提供了一定的理論依據(jù)，進一步明確了FBXO7在結(jié)直腸癌中的相關作用，為結(jié)直腸癌的治療和預后尋找到新的靶點。然而本實驗還存在一定的局限性，未探究過表達FBXO7 后調(diào)控結(jié)直腸癌增殖、周期及遷移的具體途徑及通路，并且未進行動物模型實驗驗證。針對本實驗的不足，我們將繼續(xù)通過過表達FBXO7 后檢測影響結(jié)直腸癌細胞增殖、周期及遷移的相關通路基因及蛋白的表達情況，并通過裸鼠皮下成瘤及肝肺轉(zhuǎn)移模型來進一步驗證。