賴明芬 梅家轉(zhuǎn) 朱俊林 黃甘萍 蘆青青

乳腺癌主要分為Luminal A型、Luminal B型、Her-2型、TNBC 4種分子亞型，有12%～17%的浸潤性乳腺癌屬于TNBC[1]。眾所周知，TNBC侵襲行為強，是預(yù)后最差的一種分子亞型。大多數(shù)TNBC發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，常伴有遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，從而失去根治性手術(shù)機會。由于TNBC缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及無人類表皮生長因子受體(Her-2)擴增，不能從內(nèi)分泌治療及抗Her-2靶向治療中獲益，因此放化療是目前晚期TNBC主要的治療手段，然而大多數(shù)晚期TNBC在放化療過程中常常發(fā)生轉(zhuǎn)移，這嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。鑒于TNBC更具侵襲轉(zhuǎn)移的特性，若能明確促進(jìn)TNBC發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵miRNAs及miRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并且加予阻斷，進(jìn)而降低TNBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，增加根治性手術(shù)的機會，使TNBC患者能夠從中明顯獲益。miRNAs是一類廣泛存在于真核生物的微小非編碼RNA(ncRNA)，雖占基因組的2%～5%，卻能夠調(diào)控大約50%的mRNAs，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs能夠調(diào)控腫瘤的增殖生長、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞耐藥及信號通路[3]。鑒于miRNAs在腫瘤中的作用，本研究通過生信技術(shù)篩選TNBC轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶之間表達(dá)差異的miRNAs，尋找促進(jìn)TNBC發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵miRNAs；通過分析miRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測miRNAs促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移的潛在機制；通過分析目標(biāo)mRNAs對TNBC患者DMFS的影響，進(jìn)而尋找TNBC治療新靶點和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。

1 資料與方法

我們通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)尋找TNBC微陣列，共找到2個發(fā)生轉(zhuǎn)移的TNBC微陣列，即GSE80038(發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的TNBC)、GSE38167(發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC)。設(shè)定|logFC|≥2，P<0.01作為篩選條件，分別對GSE80038、GSE38167這兩個微陣列的轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的miRNAs表達(dá)情況進(jìn)行分析，尋找轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶之間表達(dá)差異的miRNAs。通過在線工具Calculate and draw custom Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取GSE80038、GSE38167微陣列共同差異表達(dá)的miRNAs。借助targetscan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB數(shù)據(jù)庫(http://www.mirdb.org/)、miWalk數(shù)據(jù)庫(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)預(yù)測miRNAs調(diào)控的mRNAs。同樣借助在線工具Calculate and draw custom Venn diagrams獲得miRNAs在targetscan數(shù)據(jù)庫、miRDB數(shù)據(jù)庫、miWalk 3個數(shù)據(jù)庫均調(diào)控的目標(biāo)mRNAs。借助DAIVA在線工具(https://david.ncifcrf.gov/)對mRNAs進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析以及利用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=tjrG4d8rLiXM&input_page_active_form=single_identifier)進(jìn)行蛋白互作(PPI)分析，了解轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶表達(dá)差異的miRNAs及其調(diào)控的mRNAs所參與的細(xì)胞功能、信號通路及蛋白之間的相互作用及關(guān)系。借助Kaplan-Meier Plotter 在線工具(http://kmplot.com/analysis/)對GO富集分析、KEGG分析篩選出來的目標(biāo)mRNAs進(jìn)行生存分析，以P<0.05為統(tǒng)計學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)差異的miRNAs

在GEO數(shù)據(jù)庫中共找到2個發(fā)生轉(zhuǎn)移的TNBC微陣列，即GSE80038(發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的TNBC)、GSE38167(發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC)。在GSE80038微陣列中找到4個TNBC肺轉(zhuǎn)移灶芯片，4個TNBC肺轉(zhuǎn)移原發(fā)灶芯片。按照|logFC|≥2，P<0.01的篩選標(biāo)準(zhǔn)，在這8個芯片中得到264個表達(dá)差異的miRNAs，其中差異上調(diào)的miRNAs有123個，差異下調(diào)的miRNAs有141個。在GSE38167微陣列中找到13個TNBC淋巴轉(zhuǎn)移灶芯片，16個TNBC淋巴轉(zhuǎn)移原發(fā)灶芯片，在這29個芯片中得到84個表達(dá)差異的miRNAs，其中差異上調(diào)的miRNAs有23個，差異下調(diào)的miRNAs有61個。通過Calculate and draw custom Venn diagrams在線工具分別取在GSE80038、GSE38167微陣列均差異上調(diào)和下調(diào)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)在GSE80038、GSE38167微陣列均差異上調(diào)的基因有1個(hsa-miR-548k)，差異下調(diào)的基因有1個(hsa-miR-2113)(見圖1)。

注：A為上調(diào)miRNAs，B為下調(diào)miRNAs。

2.2 miRNA調(diào)控的mRNAs

為了減少mRNAs預(yù)測誤差，我們通過targetscan數(shù)據(jù)庫、miRDB數(shù)據(jù)庫、miWalk數(shù)據(jù)庫這三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-2113、hsa-miR-548k調(diào)控的mRNAs，然后通過Calculate and draw custom Venn diagrams在線工具分別取hsa-miR-2113、hsa-miR-548k在上述三個數(shù)據(jù)庫均預(yù)測到的mRNAs，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-2113在上述三個數(shù)據(jù)庫均調(diào)控的mRNAs有153個，hsa-miR-548k均調(diào)控的mRNAs有8個(見表1和圖2)。

注：A為hsa-miR-2113目標(biāo)mRNAs.B為hsa-miR-548K目標(biāo)mRNAs。

表1 3個數(shù)據(jù)庫共同表達(dá)的目標(biāo)mRNAs和miRNAs

2.3 mRNAs的GO富集、KEGG分析結(jié)果

hsa-miR-2113、hsa-miR-548k在上述三個數(shù)據(jù)庫均預(yù)測到的mRNAs共有161個，其中hsa-miR-548k的8個目標(biāo)mRNAs，hsa-miR-2113的153個目標(biāo)mRNAs。借助DAIVA在線工具對這161個目標(biāo)mRNAs進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析(以P<0.05且數(shù)目≥5作為篩選條件)，預(yù)測這161個目標(biāo)mRNAs的細(xì)胞組成、分子功能、生物過程及參與的信號通路，結(jié)果如下(見表2和圖3)。

圖3 hsa-miR-2113及hsa-miR-548K-mRNAs網(wǎng)絡(luò)

表2 目標(biāo)mRNAs 基因本體論富集分析及京都基因與基因組百科全書分析

2.4 目標(biāo)mRNAs的蛋白互作圖及相互作用關(guān)系

借助STRING在線工具和cytoscape 作圖軟件對上述161個目標(biāo)mRNAs進(jìn)行蛋白互作分析，經(jīng)過篩選后得到25個目標(biāo)mRNAs的蛋白互作圖及其相互作用關(guān)系圖(見圖4)。

圖4 目標(biāo)mRNA蛋白互作分析

2.5 影響DMFS的17個目標(biāo)mRNAs

通過GO富集分析、KEGG分析以及PPI分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-548k的目標(biāo)mRNAs，按照我們設(shè)定的篩選條件沒有得到GO富集、KEGG分析、PPI分析結(jié)果，故最后我們借助Kaplan-Meier Plotter 在線工具只對hsa-miR-2113所靶向的153個目標(biāo)mRNAs進(jìn)行生存分析，我們以無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期(DMFS)作為研究終點。以P-Value<0.05且logrankP≤0.05為篩選條件，在這161個目標(biāo)mRNAs中發(fā)現(xiàn)只有17個目標(biāo)mRNAs對DMFS的影響有統(tǒng)計學(xué)意義，其中包括：CNKSR2、PALM2、PAK3、PCDHA1、PCDHA12、PCDHA13、PCDHA11、PCDHA10、PCDHA2、PCDHA4、CHFR、ACTN1、S100PBP、STAB1、USP9Y、ZBTB37、NTNG1(見圖5)。

圖5 目標(biāo)mRNAs生存分析

3 討論

通過對hsa-miR-2113調(diào)控的153個目標(biāo)mRNAs進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)只有17個目標(biāo)mRNAs對DMFS有統(tǒng)計學(xué)意義。在這17個目標(biāo)mRNAs中，PCDHA家族占據(jù)了7個，推測PCDHA可能對TNBC患者的DMFS具有重要的影響作用。原鈣黏附因子A(PCDHA)作為鈣連蛋白超家族成員，具有與鈣連蛋白共同的同源系列，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附作用，影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)PCDHA的表達(dá)受miRNAs的調(diào)控，在前列腺癌細(xì)胞系中，miR-193a-5p能夠下調(diào)PCDHA8的表達(dá)水平，同時增加波形蛋白、降低E-鈣連蛋白的表達(dá)水平，參與前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)PCDHA10的表達(dá)水平與TNBC的DMFS有關(guān)，具有較高水平PCDHA10的TNBC患者具有較高的DMFS，PCDHA10可能作為TNBC良好預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。而PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA11、PCDHA12、PCDHA13表達(dá)低的TNBC患者其DMFS高，PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA11、PCDHA12、PCDHA13可能是TNBC較差的預(yù)后因素，這與PCDHA作為抑癌基因發(fā)揮作用的結(jié)論相反。出現(xiàn)這種矛盾，我們推測不同的PCDHA亞型以及同種PCDHA亞型在不同腫瘤類型或同一腫瘤類型不同亞型中的作用可能存在差異。另外有研究發(fā)現(xiàn)PCDHs超甲基化出現(xiàn)在多種惡性腫瘤進(jìn)程中[5]，研究發(fā)現(xiàn)差異性甲基化區(qū)域(DMRs)的成簇超甲基化參與了乳腺癌基因沉默，而DMRs的成簇超甲基化與PCDH基因家族簇密切相關(guān)[6]。眾所周知，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，而PCDHs作為miRNAs的目標(biāo)mRNAs，PCDHs的超甲基化是否是miRNAs對其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的結(jié)果，需要進(jìn)一步研究證實。

S100PBP作為S100P(鈣連接蛋白家族成員)的連接蛋白，通過調(diào)控組織蛋白酶Z，降低癌細(xì)胞間的黏附能力，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[7]。Savci-Heijink等通過分析伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的乳腺癌和不伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)S100PBP在伴內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的乳腺癌中的表達(dá)降低，認(rèn)為該基因的表達(dá)水平有助于識別乳腺癌內(nèi)臟轉(zhuǎn)移人群[8]。另外有研究發(fā)現(xiàn)miR-944能夠直接與S100PBP結(jié)合，參與癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[9]。而我們發(fā)現(xiàn)在TNBC中高水平S100PBP的DMFS越低，說明S100PBP是TNBC不良預(yù)后因素，這與S100PBP在內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的乳腺癌中表達(dá)降低結(jié)論不一致。我們推測可能是由于Savci-Heijink的研究沒有對乳腺癌分子亞型進(jìn)行區(qū)分，S100PBP在乳腺癌中的作用可能受ER、PR、Her-2水平的影響。

SATB1是富含AT連接蛋白1序列的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，通過與染色體上富含T的序列結(jié)合，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。我們通過分析SATB1與DMFS的影響發(fā)現(xiàn)SATB1的水平與DMFS呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，SATB1可能是TNBC較好預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。而Wang等通過分析乳腺癌組織及癌旁組織中SATB1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SATB1在正常組織的表達(dá)水平很低，而在腫瘤組織中表達(dá)增高，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與年齡、絕經(jīng)期、PR和Her-2蛋白表達(dá)無關(guān)，而與腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理級別、腫瘤分級、ER蛋白表達(dá)相關(guān)[10]。另外，近年來有研究發(fā)現(xiàn)SATB1通過染色體基因重組促進(jìn)包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中高表達(dá)的SATB1顯著增加了癌細(xì)胞浸潤能力，其表達(dá)水平與生存呈負(fù)相關(guān)[11]。認(rèn)為KI67和SATB1可能是乳腺癌總生存期預(yù)后的獨立因子[12]。這與我們的研究結(jié)果不一致，推測這可能是ER蛋白對SATB1影響的結(jié)果。

CHFR是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，具有絲分裂檢查點和抑癌基因的作用。通過作用泛素連接酶，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白B1-Cdk的形成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯。CHFR還能夠通過RNA連接鋅指結(jié)構(gòu)與PARP-1結(jié)合，阻斷TOPK介導(dǎo)的AKT活化，阻斷G2/M進(jìn)程。在乳腺癌細(xì)胞中降低CHFR的表達(dá)能夠加快癌細(xì)胞生長速度、增強侵襲和克隆的形成[13]。而我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)低的CHFR具有更高的DMFS，這與乳腺癌細(xì)胞中降低CHFR的表達(dá)能夠加快癌細(xì)胞生長速度、增強侵襲和克隆的形成觀點不一致。這可能在不同分子亞型的TNBC中CHFR的作用是不同。

Savci-Heijink等[14]通過分析乳腺癌骨轉(zhuǎn)移與乳腺癌非骨轉(zhuǎn)移之間的基因表達(dá)差異情況，尋找促進(jìn)乳腺癌定向性骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)15個基因與乳腺癌定向骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，能夠作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測基因，其中包括PALM2。我們的研究發(fā)現(xiàn)PALM2越高，則TNBC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性越大，推測PALM2可能具有促進(jìn)TNBC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。CNKSR2在乳腺癌組織與非癌組織中表達(dá)存在差異，并且發(fā)現(xiàn)CNKSR2表達(dá)水平與ER、PR、Her-2狀態(tài)相關(guān)。在高HER-2、低ER和PR狀態(tài)的乳腺癌亞型中，CNKSR2的表達(dá)相對較高，并且高水平的CNKSR2促進(jìn)乳腺細(xì)胞發(fā)生惡變[15]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)具有較高CNKSR2的TNBC患者其DMFS較高，CNKSR2是TNBC良好預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。USP9Y編碼類似于泛素特異性的蛋白酶，對保護(hù)蛋白免受蛋白酶降解具有重要的調(diào)節(jié)作用。在前列腺癌發(fā)展過程中USP9Y表達(dá)下降，認(rèn)為USP9Y可能作為腫瘤預(yù)后預(yù)測指標(biāo)[16]。ACTN1在乳腺癌中表達(dá)增高，能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移、降低E-鈣粘蛋白的黏附作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且與基底樣乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)[17]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)ACTN1與TNBC不良預(yù)后相關(guān)。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)p21激活的激酶3(PAK3)能夠增強胸腺類癌細(xì)胞遷移和侵襲，說明PAK3可能是胸腺類癌不良預(yù)后因素，我們同樣也發(fā)現(xiàn)PAK3是TNBC不良預(yù)后因素，PAK3與TNBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。ZBTB37是芳烴受體(AhR)的目標(biāo)基因，調(diào)控造血干細(xì)胞髓內(nèi)和髓外造血，參與多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生[19]。我們通過對ZBTB37與DMFS的生存分析發(fā)現(xiàn)，ZBTB37是TNBC不良預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，推測ZBTB37可能是通過影響造血干細(xì)胞來促進(jìn)TNBC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過分析這17個目標(biāo)mRNAs在腫瘤中的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)它們能夠調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，我們通過生存分析發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平與TNBC的DMFS相關(guān)，能夠作為TNBC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)，它們有可能作為TNBC治療新靶點。

GO富集分析一般包括細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)、以及生物過程(BP)。通過表4可知目標(biāo)mRNAs的功能主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞間黏附以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面。在KEGG分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)mRNAs主要參與軸突導(dǎo)向及癌癥相關(guān)通路。GO富集結(jié)果中的細(xì)胞間黏附、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及KEGG分析結(jié)果中癌癥通路說明miRNAs及其所調(diào)控的目標(biāo)mRNAs網(wǎng)絡(luò)與TNBC轉(zhuǎn)移相關(guān)。

TNBC是乳腺癌的一種分子亞型，由于缺乏ER、PR、Her-2擴增，不能從內(nèi)分泌治療及抗Her-2靶向治療中獲益。目前TNBC的主要治療手段包括手術(shù)、放療以及化療，然而大多數(shù)TNBC發(fā)現(xiàn)時常常處于晚期，因此放化療成為晚期患者的主要治療手段。TNBC因具有較強的侵襲行為，大多數(shù)TNBC患者在放化療過程中出現(xiàn)臟器轉(zhuǎn)移[2]。大量研究[3]發(fā)現(xiàn)miRNAs異常表達(dá)與腫瘤增殖生長、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞耐藥及信號通路密切相關(guān)。miR-10b、miR-26a、miR-146a、miR-15能夠調(diào)控BRCA1的表達(dá)參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)miR-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)增高，并且能夠刺激促轉(zhuǎn)移基因RHOC表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TNBC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[20]。miR-21的表達(dá)水平與TNBC晚期臨床階段、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞擴散、不良預(yù)后相關(guān)，認(rèn)為miR-21能夠作為TNBC患者預(yù)后的預(yù)測因素[21]。而miR-15a通過作用于CCNE1，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且認(rèn)為miR-15a可能是TNBC預(yù)后預(yù)測因素[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-2113、hsa-miR-548k在TNBC轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中存在差異，我們推測hsa-miR-2113、hsa-miR-548k可能是促進(jìn)TNBC發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵miRNAs，但關(guān)于這兩者在乳腺癌方面的研究尚未見報道。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)有17個mRNAs對DMFS有統(tǒng)計學(xué)意義，可能作為TNBC預(yù)后預(yù)測指標(biāo)和治療新靶點。由于我們的研究是借助前人的微陣列信息進(jìn)行的，缺乏相關(guān)實驗研究。后期我們將進(jìn)行功能實驗驗證上述miRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其功能，期望能找到促進(jìn)TNBC發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵miRNAs及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為TNBC治療提供新靶點和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。