董 宇 馬淑盟 劉 芬 路喜安

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，據(jù)研究顯示，膀胱癌發(fā)病率與病死率呈逐漸上升的趨勢，其復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，預(yù)計后期發(fā)展不容樂觀[1-4]。膀胱癌在65歲以上的人群中有很高的發(fā)病率，但近年來發(fā)現(xiàn)，發(fā)病年齡逐漸降低，有低齡化趨勢，而男性發(fā)病率比女性高，男女發(fā)病率比例為3∶1～4∶1[5]。所以，目前要解決的問題是尋找特異性靶向治療目標(biāo)。P21活化激酶(p21-activated kinases，PAKS)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，近年來有研究顯示，作為小G蛋白Rho家族Cdc42和Racl的下游效應(yīng)分子，在腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮促進細(xì)胞信息傳導(dǎo)、抑制細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞增生、血管生成等重要作用[6]。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是P21活化激酶的6個成員之一，也是首個發(fā)現(xiàn)與激素受體作用相關(guān)的成員。PAK6基因位于人染色體15q14區(qū)，編碼的蛋白質(zhì)為75 kD蛋白質(zhì)。以往研究發(fā)現(xiàn)PAK6在肝癌與前列腺組織中有高表達，但目前很少有PAK6在膀胱癌組織中的研究。p53基因是細(xì)胞中期中重要的調(diào)節(jié)因子，一般認(rèn)為是參與DNA的修復(fù)和復(fù)制過程，具調(diào)節(jié)血管生成、促進凋亡等作用。Biu-87、T24細(xì)胞均為膀胱癌細(xì)胞，來源于人膀胱癌；SV-HUC-1細(xì)胞為正常膀胱細(xì)胞。本實驗中通過檢測膀胱癌患者組織中PAK6、p53表達以及Biu-87、T24、SV-HUC-1細(xì)胞中PAK6、p53表達，探討PAK6、p53在膀胱癌組織以及膀胱癌細(xì)胞中的表達狀況以及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年2月至2018年2月診治的膀胱癌患者85例，設(shè)為膀胱組，其中男性67例，女性18例；年齡44～86歲；原發(fā)膀胱癌53例，復(fù)發(fā)膀胱癌32例；取以上患者的膀胱癌組織進行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選患者手術(shù)后通過病理活檢證實為膀胱癌；②在手術(shù)前均沒有任何放療、化療、激素治療、免疫治療等；③所有進入此研究的患者均簽署過知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等主要器官病變的患者。取35例同時期行膀胱部分切除或者全部切除的患者，設(shè)為對照組，男性23例，女性12例；年齡54～70歲；再取其正常的膀胱上皮組織進行研究。2組患者的年齡、性別比例等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究中所使用的Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞、SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會細(xì)胞庫，分別為Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞，用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基放入溫度37 ℃且含有5%CO2的培養(yǎng)箱中進行孵育，2～3天后細(xì)胞培養(yǎng)完成可用于實驗。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測膀胱組與對照組組織PAK6蛋白陽性表達 膀胱組與對照組組織用10%甲醛固定，用乙醇脫水，再用石蠟包埋后制作成4 μm厚度的連續(xù)切片，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。將石蠟切片放入溫度為60 ℃的溫箱中干燥0.5～1 h，再用二甲苯進行脫蠟，梯度乙醇進行水化。之后用高壓抗原修復(fù)法對抗原進行修復(fù)，內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑浸泡10 min，PBS液沖洗3次，免疫血清封閉10 min，PBS液沖洗3次。后除去PBS加入稀釋過的一抗，即濃度為1∶200的PAK6/P30，溫度4 ℃下過夜，PBS沖洗3次；再滴加二抗，即被生物素標(biāo)記過的羊抗鼠/兔IgG；在室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次；再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化氫酶，繼續(xù)在室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次；然后滴加新鮮配置的DAB溶液進行顯色，用流水沖洗；用蘇木精復(fù)染，再用鹽酸乙醇分化，流水沖洗，用梯度乙醇進行脫水干燥，二苯甲透明，中性樹膠封片。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：每張切片都隨意選取5個高倍鏡下視野(×400)，分別觀察染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)。首先按照染色情況進行計分：無著色計分為0，淡黃色計分為1，棕黃色計分為2，棕褐色計分為3。然后按照陽性細(xì)胞所占所有細(xì)胞數(shù)量的百分比進行計分：陰性計分為0，陽性細(xì)胞百分比為≤10%計分為1，百分比>10%～50%計分為2，>50%～75%計分為3，>75%則計分為4。計算染色強度所計分和陽性細(xì)胞百分率乘積，若得到的值>3分則記為免疫反應(yīng)陽性。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組PAK6、p53 mRNA表達水平 取出用6板孔培養(yǎng)好的3組細(xì)胞，沖洗，在每個孔中加入500 μl Trizol試劑并按照步驟提取出細(xì)胞中的總RNA，并使用分光光度儀檢測RNA濃度。再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA合成cRNA，根據(jù)合成的模板cRNA對PAK6及p53基因進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列可見表1。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TapⅡ10 μl，模板DNA 2 μl，正向引物0.8 μl，ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，DEPC H2O 6 ml。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 10 s。共進行40個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取5 μl擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱組與對照組組織PAK6、p53陽性表達率的比較

膀胱癌組組織的PAK6蛋白陽性表達率與對照組相比較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.87，P<0.05)。膀胱癌組組織的p53蛋白陽性表達率與對照組相比較明顯較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.75，P<0.05)。見表2。

表2 2組PAK6、p53陽性表達率比較(例，%)

2.2 膀胱癌組組織中PAK6、p53蛋白陽性表達率與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

膀胱癌組PAK6蛋白陽性表達率在腫瘤的數(shù)量、病例分級、轉(zhuǎn)移情況以及臨床分期方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。膀胱癌組復(fù)發(fā)者PAK6蛋白陽性表達率(28.13%)相對于原發(fā)者(56.60%)較低(P<0.05)。由數(shù)據(jù)可知，膀胱組單發(fā)者p53蛋白陽性表達率明顯低于多發(fā)者，病理等級低者p53蛋白陽性表達率明顯低于高級別，臨床分期淺表性癌p53蛋白陽性表達率明顯低于浸潤性，膀胱癌組復(fù)發(fā)者p53蛋白陽性的表達率明顯高于原發(fā)者，膀胱組轉(zhuǎn)移者p53蛋白陽性表達率明顯高于未轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 膀胱癌組PAK6、p53表達與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系(例，%)

2.3 Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組細(xì)胞PAK6、p53 mRNA表達水平的比較

Biu-87組、T24組和SV-HUC-1組3組細(xì)胞PAK6、p53 mRNA的表達水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.559，P=0.002)。SV-HUC-1組PAK6 mRNA表達水平(0.44±0.13)高于Biu-87組以及T24組(0.20±0.1、0.12±0.11)(t=13.49，P<0.01；t=17.32，P<0.01)，而Biu-87組PAK6 mRNA表達水平明顯比T24組高(t=4.96，P<0.01)。SV-HUC-1組p53 mRNA表達水平(0.36±0.12)低于Biu-87組(0.53±0.21)以及T24組(0.65±0.11)(t=6.48，P<0.01；t=16.42，P<0.01)且Biu-87組p53 mRNA表達水平明顯比T24組低(t=4.67，P<0.01)。

3 討論

膀胱癌是泌尿系常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率均居惡性腫瘤的前列，且近些年來，膀胱癌的發(fā)病率與病死率逐漸升高，主要的發(fā)病年齡在中年后[7]。膀胱癌有易侵襲，復(fù)發(fā)率高，易耐藥等多種特性[8]。PAKs是絲氨酸/蘇氨酸家族之一，在生長因子信號中有十分重要的作用，可以引起細(xì)胞骨架重組，并對遷移和轉(zhuǎn)移生長因子介導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響[9-10]。雖然PAKs家族蛋白在癌癥中并不會發(fā)生突變，但是他們在一些癌癥中表達或者擴增過度使其變成對我們極具吸引力的治療靶點[11]。但是目前在對PAKs的研究中，很少出現(xiàn)對PAK6相關(guān)方面的研究。PAK6能夠促進部分腫瘤進展，具有致瘤性，在原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中有高表達，還在去勢治療后復(fù)發(fā)的患者中有著高表達[12-13]。在研究中發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，PAK6可使雄激素受體的ser-578磷酸化，促進雄激素受體-泛素化蛋白連接酶結(jié)合，在雄激素刺激下使得雄激素受體被降解，抑制了雄激素受體和轉(zhuǎn)移[14-16]。同時，PAK6也可以通過雄激素受體-泛素化蛋白連接酶的ser-158與ser-186磷酸化，來調(diào)節(jié)雄激素受體的降解[17]。研究證明，PAK6與雄激素受體表達呈負(fù)相關(guān)，PAK6下降則會促進腫瘤進展。近年來有部分研究證明，PAK6在一些癌癥，如前列腺癌、結(jié)腸癌等中為致癌因子，幾乎沒有文獻研究PAK6在膀胱癌中的表達情況。而p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性較高的抑癌基因，也是研究廣泛的基因之一，他們具有抑制細(xì)胞生長和腫瘤形成的功能。研究表明，突變型p53基因?qū)?xì)胞凋亡有一定的抑制作用，人體組織中過量表達的p53蛋白通常都是由p53基因突變而引起的。突變型p53基因目前已經(jīng)證實了與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。

通過免疫組織化學(xué)法對膀胱癌患者的膀胱組織和對照組正常膀胱組織的PAK6蛋白陽性表達率進行檢測，發(fā)現(xiàn)人膀胱癌組織中的PAK6主要定于細(xì)胞質(zhì)，還有少量的PAK6定于細(xì)胞核，而通過數(shù)據(jù)顯示PAK6在膀胱癌組織中表達較低，在正常膀胱組織中表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)膀胱癌組PAK6表達與臨床病理指標(biāo)之間得出膀胱癌組復(fù)發(fā)者的PAK6蛋白陽性表達率(28.13%)相對于原發(fā)者(56.60%)較低，提示PAK6與膀胱癌的復(fù)發(fā)性有一定的關(guān)系。而在腎透明細(xì)胞癌中，有學(xué)者證明，PAK6低表達患者預(yù)后不佳，總體存活率與無復(fù)發(fā)存活率都很低[18-19]。有研究表明，在膀胱癌的發(fā)生和進展中雄激素受體信號通路有十分重要的作用，可能會與在膀胱癌中的PAK6的作用有十分密切的關(guān)系[20-21]，本研究證明膀胱癌細(xì)胞中PAK6表達比正常膀胱癌細(xì)胞低，PAK6在膀胱癌發(fā)展的過程中具有一定的抑瘤作用，但是，其具體的發(fā)生機制以及對膀胱癌的預(yù)后影響還有待進一步的研究。為避免在上述研究過程中出現(xiàn)失誤，我們又采用實時熒光定量PCR法檢測Biu-87、T24膀胱癌細(xì)胞以及SV-HUC-1正常膀胱細(xì)胞的PAK6 mRNA表達水平來驗證上面的實驗結(jié)果。結(jié)果得出Biu-87組、T24組細(xì)胞PAK6 mRNA表達水平均低于SV-HUC-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果與前面一致，由此可知，PAK6在膀胱癌中為低表達狀態(tài)，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)有很密切的關(guān)系。

膀胱組的p53蛋白陽性表達率與對照組相比較明顯較高，p53在膀胱癌細(xì)胞中表達較高，在正常細(xì)胞中表達較低。并且，由結(jié)果可以看出，p53蛋白陽性表達與膀胱癌臨床分期、病理分級等密切相關(guān)，還與膀胱癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有很大的聯(lián)系。正常體細(xì)胞p53基因為編碼53kD的磷酸結(jié)合核蛋白，后者還被稱為野生型p53蛋白，野生型p53蛋白通過影響基因的轉(zhuǎn)錄，來干擾DNA起始，促進細(xì)胞的終末分化程序化死亡，發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，進而組織細(xì)胞癌變。而p53基因突變產(chǎn)物不僅不會發(fā)揮抑癌作用，而且還會促進細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，它的積聚與膀胱癌的分級、腫瘤增殖與進展有密切的聯(lián)系。而我們在檢測膀胱癌細(xì)胞中的p53時，檢測出的都是突變型p53，而隨著腫瘤程度的上升，p53陽性表達率也會逐漸上升。為檢驗結(jié)果，我們用另外3組細(xì)胞進行檢驗，Biu-87組、T24組細(xì)胞p53 mRNA表達率與p53 蛋白表達率均高于SV-HUC-1組，與上述結(jié)果一致。

綜上所述，PAK6在膀胱癌中表達異常，與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系，并且在膀胱癌的復(fù)發(fā)中有重要作用，PAK6可能會作為新的抑癌指標(biāo)用以指導(dǎo)臨床。本研究也證明了p53在膀胱癌組織以及膀胱癌細(xì)胞中有高表達，并且與膀胱癌臨床分期等有密切聯(lián)系，可作為評估膀胱癌預(yù)后的標(biāo)志物。