傳鋒彬 王 雯 王立宏

在全世界范圍內(nèi)，肺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥。臨床上將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。表皮生長因子受體(EGFR)是1種具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，在NSCLC中常發(fā)生突變，是肺腫瘤發(fā)生的原因[2]。最常見的EGFR突變是外顯子19缺失和外顯子21中的p.l858R突變，這些突變可導致EGFR酪氨酸激酶域的過度激活[3]，進而導致肺癌發(fā)生。對于大多數(shù)肺癌晚期患者而言，常規(guī)順鉑化療僅可使患者的中位生存時間延長至8～11個月[4]。最近，臨床研究表明EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)用于EGFR突變癌癥的治療已非常成功[5]。兩種EGFR-TKIs(吉非替尼和厄洛替尼)仍然是NSCLC患者的一線治療方法[6]，然而隨著EGFR-TKIs的應用，患者對其的耐藥性也迅速發(fā)展[7]。因此，研究EGFR突變型肺癌的詳細分子機制對肺癌的治療非常重要。本研究旨在探討EGFR介導的信號通路對肺癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移的影響，并分析其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 肺癌組織采集

收集2017年1月至2019年1月渭南市中心醫(yī)院病理科保存的人NSCLC癌組織的石蠟塊34例，其中17例為EGFR突變肺癌組織。EGFR突變肺癌組織均經(jīng)病理技師采用實時定量PCR及基因測序法對EGFR外顯子19～21基因突變分析確定。正常肺組織石蠟塊12例，無EGFR突變組織。所有患者術(shù)前均未接受過放化療及EGFR-TKI治療等抗腫瘤治療。所有標本均用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋保存。

1.2 免疫組化檢測肺癌組織中DDX59陽性率

采用切片機將NSCLC癌組織及正常肺組織的石蠟塊切為5 μm厚的薄片，置于載玻片上。經(jīng)二甲苯脫蠟及各級乙醇脫水后，采用Tris緩沖液(pH 9.0)進行抗原熱修復，然后置于1%過氧化氫甲醇溶液中30 min使內(nèi)源性過氧化物酶失活。10%胎牛血清封閉30 min，加入一抗DDX59抗體(1∶50，Santa Cruz)，4 ℃孵育30 min，之后基于DAKO公司的envision試劑盒按照標準化程序采用聚合物放大信號。用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果由2位病理科醫(yī)師盲法做出判定。DDX59陽性的判斷標準：DDX59表達以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。染色強度評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞百分比評分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為陽性細胞10%～50%，3分為陽性細胞50%～75%，4分為陽性細胞≥75%。DDX59陽性以染色強度評分乘以陽性細胞百分比評分得出的結(jié)果，≥3分為陽性，3分為陰性。

1.3 Western Blot檢測重組EGF對人正常肺上皮細胞中DDX59蛋白表達的影響

人正常肺上皮細胞系BEAS-2B購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將細胞培養(yǎng)在含20%胎牛血清和8% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。采用100 ng/ml重組EGF(武漢艾美捷科技有限公司)干預BEAS-2B細胞0 h、4 h、8 h、12 h后，收獲細胞，采用Western Blot檢測各時間點DDX59蛋白的表達。另外，采用0 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml重組EGF干預BEAS-2B細胞4 h后，收獲細胞，采用Western Blot檢測各濃度梯度DDX59蛋白的表達。各設4個復孔。

采用RIPA裂解液從細胞中提取總蛋白，用BCA試劑盒定量總蛋白。取20 g總蛋白加入上樣緩沖液中，用10%SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，之后將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉45 min，加入一抗DDX59(1∶200，Santa Cruz)，4 ℃封閉過夜。加入二抗(1∶10000，上海碧云天)，室溫搖床孵育1 h，采用電化學發(fā)光試劑ECL在暗室發(fā)光。用Image J軟件統(tǒng)計分析目的條帶。GAPDH為內(nèi)參。

1.4 Western Blot檢測MAPK途徑阻斷對EGFR突變的人肺癌細胞系H1975中DDX59蛋白表達的影響

EGFR突變的人非小細胞肺癌細胞系H1975購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將細胞培養(yǎng)在含20%胎牛血清和8%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。分別采用Ras抑制劑(2.5 M的索拉非尼)、Raf抑制劑(50nM的替吡法尼)、MAPK抑制劑(10 M的PD184352)干預H1975細胞24 h，用MEK抑制劑(10 M的U0126)干預H1975細胞8 h，之后收獲細胞，采用Western Blot檢測經(jīng)不同MAPK途徑阻斷劑處理后H1975細胞中p-ERK、p-ERK和DDX59蛋白的表達。用DMSO干預作為對照。各設4個復孔。MAPK途徑阻斷劑均購自廣州Selleck公司，并根據(jù)Selleck推薦的實驗條件進行干預處理。

1.5 MTT法檢測DDX59抑制對H1975細胞增殖活性的影響

慢病毒載體介導的靶向DDX59的shRNA購自上海吉凱公司。序列為：人sh-DDX59-1：5'-CCCATTCAAATGCAGATGATT-3'，人sh-DDX59-2：5'-GCGAGCTTTATTCGAGAGCAA'，另合成對照sh-RNA。用脂質(zhì)體2000將慢病毒介導的sh-DDX59-1、sh-DDX59-2和對照sh-RNA轉(zhuǎn)染至H1975細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，收獲細胞，采用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，只加培養(yǎng)液設為空白孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入5 g/l MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，加入150 μl的DMSO。用酶標儀在570 nm處檢測吸光值(A)。細胞增殖率(%)=A試驗孔/A空白孔×100%。

1.6 劃痕實驗檢測DDX59抑制對H1975細胞遷移的影響

將H1975細胞以5×103個/孔的密度接種于24孔板，形成單層貼壁細胞，細胞匯合度達到70%時進行1.5部分轉(zhuǎn)染。待細胞長至100%時，用200 μl移液器槍頭在單層細胞上劃痕，此時記錄0 h時創(chuàng)面寬度(μm)。孵育24 h后，記錄24 h時創(chuàng)面寬度(μm)。細胞遷移率(%)=24 h時劃痕寬度(μm)/0 h時劃痕寬度(μm)×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DDX59蛋白在EGFR突變肺癌組織中高表達

如表1所示，正常肺組織中DDX59陽性率為0%(0/12)，肺癌組織為55.9%(19/34)，EGFR突變肺癌組織為70.6%(12/17)，對比差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=15.341，P<0.05)。

表1 各組DDX59陽性率對比(例，%)

2.2 EGF對正常人肺上皮細胞中DDX59表達的影響

如圖1所示，與干預0 h對比，100 ng/ml的重組EGF干預正常人肺上皮細胞4 h、8 h和12 h可顯著增加DDX59蛋白表達(P<0.05)。與0 ng/ml的重組EGF相比，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重組EGF干預正常人肺上皮細胞4 h可顯著增加DDX59蛋白表達(P<0.05)。

注：左圖為不同干預時間，右圖為不同作用濃度。

2.3 MAPK途徑阻斷對EGFR突變的人肺癌細胞中DDX59表達的影響

如表2所示，與DMSO對比，Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑均可顯著降低p-ERK和DDX59的蛋白表達(P<0.05)，對ERK蛋白的表達無顯著影響。

表2 不同MAPK途徑阻斷劑對EGFR突變肺癌細胞中DDX59表達的影響

2.4 DDX59對EGFR突變肺癌細胞增殖和遷移的影響

如表3所示，與sh-RNA對比，sh-DDX59-1和sh-DDX59-2可顯著降低DDX59蛋白表達、細胞增殖率和細胞遷移率(P<0.05)。

表3 各組細胞增殖率及遷移率對比

3 討論

DDX59屬于DEAD/DEAH盒RNA解旋酶家族，RNA解旋酶可以將ATP水解作用與RNA/DNA構(gòu)象變化進行偶聯(lián)，在RNA代謝中發(fā)揮非常重要的作用[8]。之前的報道顯示DDX59突變參與口面指綜合征的發(fā)病機制[9]。通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(www.cbioportal.org)分析發(fā)現(xiàn)DDX59常在人肺癌中表達上調(diào)，且免疫組織化學分析證實DDX59陽性表達占95例總NSCLC患者癌組織近一半左右[10]。此研究進一步發(fā)現(xiàn)DDX59可通過促進DNA復制參與肺腫瘤發(fā)生[10]。然而，目前關(guān)于DDX59在肺癌中受到何種調(diào)節(jié)尚未徹底闡明。在本研究中，我們檢測到55.9%(19/34)的肺癌組織中DDX59高表達，其中17例EGFR突變肺癌組織中有12例(70.6%)DDX59高表達，因此我們推測DDX59高表達可能與EGFR突變相關(guān)。

為進一步證實上述推測，我們采用重組EGF體外干預正常人肺上皮細胞，采用Western Blot檢測干預后DDX59蛋白的表達，結(jié)果顯示100 ng/ml的重組EGF干預正常人肺上皮細胞4 h、8 h和12 h可顯著增加DDX59蛋白表達，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重組EGF干預正常人肺上皮細胞4 h可顯著增加DDX59蛋白表達。這些結(jié)果提示EGF可增加正常肺上皮細胞中DDX59的表達，已知EGFR突變導致的酪氨酸激酶域過度激活是肺癌發(fā)生的原因，因此可以推斷EGF導致的DDX59上調(diào)可能是EGFR突變致癌的分子機制之一，即DDX59上調(diào)參與EGFR突變導致肺癌發(fā)生的過程。

DDX59在進化上高度保守，其可通過修飾RNA分子的構(gòu)象從而影響RNA代謝而發(fā)揮作用。很少有研究涉及DDX59在細胞中的生物化學作用，其底物特異性和分子機制也很大程度上未被探索[10]。已知MAPK信號途徑是EGFR的胞內(nèi)下游信號通路[11]，本研究也已證實EGF上調(diào)DDX59，因此我們推測DDX59和MAPK信號途徑可能存在相互調(diào)控作用，并且為EGFR的下游信號通路。為驗證此推測，我們采用MAPK途徑的4個抑制劑(Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑)干預EGFR突變的人肺癌細胞，檢測這些抑制劑對DDX59蛋白表達的影響。結(jié)果顯示Ras抑制劑、Raf抑制劑、MEK抑制劑和MAPK抑制劑均可顯著降低p-ERK和DDX59的蛋白表達，表示MAPK途徑抑制可降低DDX59的蛋白表達，MAPK途徑為DDX59的上游信號通路，負責DDX59的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。為了進一步證明DDX59上調(diào)參與EGFR突變導致肺癌發(fā)生的過程，我們將慢病毒載體介導的靶向DDX59的shRNA轉(zhuǎn)染入EGFR突變的人肺癌細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sh-DDX59可顯著降低肺癌細胞的增殖率和遷移率，表明DDX59表達下調(diào)可抑制肺癌細胞的增殖和遷移，提示DDX59參與EGFR突變的人肺癌發(fā)生過程。由于腫瘤是高度異質(zhì)的，其他的突變與EGFR突變共存。DDX59也可能受其他癌基因或腫瘤抑制因子的調(diào)控。這可以部分解釋為什么DDX59未能在所有EGFR突變體患者中表達。

EGFR介導的DDX59蛋白上調(diào)參與肺癌的發(fā)生過程，DDX59受MAPK途徑的調(diào)控。值得注意的是，除肺癌外，還發(fā)現(xiàn)DDX59基因經(jīng)常在其他類型的癌癥中表達，如乳腺癌、肝癌等。因此DDX59在其他類型的癌癥中的作用也值得進一步研究，并評估其在多種人類癌癥中的作用。本研究對DDX59調(diào)節(jié)和功能的研究暗示了這種DEAD盒RNA解旋酶在促進癌癥發(fā)展中的潛在重要性及其在肺癌患者中的治療價值。