陳俊妮 袁 波 陳集敏 陳春吉 楊時平 王 奮 王一鳴

遠處轉移是鼻咽癌患者治療失敗的主要原因[1-2]，研究鼻咽癌轉移的分子機制，尋找治療靶點，對提高鼻咽癌患者生存率，具有重要的臨床意義。大量文獻報道趨化因子受體4(chemokine receptor 4,CXCR4)具有促進腫瘤生長和轉移的作用。目前已在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、卵巢癌、食管癌、頭頸部鱗狀細胞癌等多種腫瘤細胞中檢測到CXCR4高表達[3-10]。Tao等[11]和Segawa等[12]在鼻咽癌腫瘤組織中檢測到CXCR4蛋白高表達。鼻咽癌作為南方高發(fā)惡性腫瘤，與EB病毒感染密切相關，潛伏膜蛋白1(latent membraneprotein-1,LMP-1)是EB病毒編碼產(chǎn)物中被證實具有癌基因功能的蛋白質之一，在鼻咽癌侵襲和轉移中起著重要的作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)LMP-1可激活NF-KB信號通路[14]，而另有研究報道NF-KB信號通路可上調CXCR4表達，從而促進腫瘤細胞的遷移和轉移[15]。目前關于LMP-1與CXCR4在鼻咽癌組織中的表達是否存在相關性報道較少。該研究采用免疫組化檢測LMP-1蛋白和CXCR4蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況，并分析兩者是否存在相關性及其臨床意義?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2013年12月至2015年5月在海南省人民醫(yī)院放療科診治且經(jīng)鼻咽活檢病理診斷為鼻咽癌的初診患者66例，中位年齡49歲(30～73歲)，男性48例，女性18例。所有患者在治療前均接受全身檢查以排出骨及臟器等全身轉移，并經(jīng)AJCC8th重新分期：T1期1例，T2期21例，T3期27例，T4期17例；N0期1例，N1期15例，N2期28例，N3期22例。Ⅱ期5例，Ⅲ期27例，Ⅳa期34例。病理類型：未分化型非角化性癌56例，分化型非角化性癌10例。所有入組對象均告知試驗的目的和可能存在的風險，征得同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

鼠抗人LMP-1單克隆抗體購自Gene company公司，鼠抗人CXCR4單克隆抗體購自R&D Systems公司，山羊抗小鼠二抗試劑盒、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer，CB)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、多聚賴氨酸硅化載玻片購自北京中杉金橋公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自福建邁新公司。SP試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。切片機、雙目顯微鏡、恒溫孵育箱、微波爐等常規(guī)實驗設備，無水酒精、二甲苯伊紅、蘇木精等普通試劑由我院病理科提供。

1.3 標本處理和檢測

石蠟標本以4 μm連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度水化；加一滴3 %過氧化氫,室溫下孵育15 min，滴加正常山羊血清封閉20 min,分別滴加1∶100稀釋的LMP1和1∶600稀釋的CXCR4單克隆抗體,4 ℃過夜;然后滴加1∶100生物素標記的二抗,室溫孵育15 min，滴加1∶100 辣根過氧化物酶標記的卵白素,室溫孵育15 min，滴加DAB顯色,蘇木精復染,脫水、透明、中性樹膠封片,鏡檢。用磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffered saline,PBS)代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

腫瘤細胞染色呈淺黃、不均勻著色，判為弱染色；染色呈黃褐色，著色比較均勻，判為中等染色；染色呈棕褐色，著色均勻者判為強染色。采用半定量積分法判斷結果,隨機觀察10個高倍視野(×400)：①細胞染色強度:不染色0分、弱染色(淺黃色)1分、中等染色(黃褐色)2分，強染色(棕褐色)3分；②陽性細胞占視野細胞總數(shù):0～5%得0分,6%～25%得1分,26%～50%得2分,51%～75%得3分,76%～100%得4分。兩項得分相加,≥4分為陽性。

1.5 隨訪方法

隨訪形式為：返院復查、電話隨訪。放療結束后前2年，每3個月復查1次，2年以后每6個月復查1次。5年以后每年復查1次。隨訪內(nèi)容包括完善的體檢、胸部CT、腹部彩超、纖維鼻咽鏡、鼻咽及頸部MRI、全身骨顯像等。

1.6 統(tǒng)計方法

應用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗分析轉移組和非轉移組間兩蛋白表達差異。采用Spearman 等級相關分析兩蛋白表達相關性。采用Kaplan-Meier法計算生存率并應用Logrank法單因素預后分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LMP-1和CXCR4在鼻咽癌組織中的表達

66例鼻咽癌組織中，LMP-1陽性50例，陽性率為75.76%。CXCR4陽性65例，陽性率為98.48%。LMP1陽性細胞著色定位于細胞膜、細胞質，根據(jù)染色強弱表現(xiàn)，不染色3例，弱染色有40例，中等染色23例。CXCR4陽性細胞著色定位于胞膜、胞質、細胞核。根據(jù)染色強弱表現(xiàn)，弱染色有16例，強染色50例。

2.2 LMP-1和CXCR4與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系

LMP1蛋白在N0～1、N2和N3分期患者中陽性表達率分別為56.25%、75.00%和90.91%(P<0.05)。LMP-1蛋白在GTVnd<49.15 cm3和GTVnd≥49.15 cm3兩組中陽性表達率分別為：69.81% vs.100%,(P<0.05)。由此說明：N分期越高或腫瘤體積越大，LMP-1陽性表達率越高。因CXCR4陽性率高達98.48%，因此根據(jù)CXCR4染色強弱進行分層研究，結果顯示：CXCR4蛋白染色強弱在各組間無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 LMP-1蛋白表達和CXCR4蛋白染色強弱與臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 LMP-1與CXCR4蛋白表達的相關性分析

采用Spearman等級相關分析：LMP-1蛋白表達與CXCR4染色強弱是否存在相關性，結果顯示：相關系數(shù)為0.010，P=0.936，因此兩者表達不存在相關性。

2.4 LMP-1及CXCR4表達與預后的關系

LMP-1蛋白在遠處轉移組和無轉移組陽性率分別為100.00%和68.63%。CXCR4染色強弱在組間的差異無統(tǒng)計學意義。由此說明：LMP-1陽性組鼻咽癌患者更容易發(fā)生遠處轉移，見表2。

表2 LMP1蛋白表達及CXCR4染色強弱與復發(fā)和遠處轉移的關系(例，%)

2.5 生存分析

根據(jù)LMP-1蛋白表達將66例患者分成陰性組和陽性組，3年總生存率(OS):93.8% vs.70%(χ2=3.775,P=0.052);3年無進展生存率(PFS):93.8% vs.63.4%,(χ2=5.267,P=0.022);3年無遠處轉移生存率(DMFS):100% vs.71%(χ2=5.788,P=0.016);3年無復發(fā)生存率(RFS):93.8% vs.88.9%(χ2=0.271,P=0.603)，見圖1。CXCR4染色強弱兩組的3年OS、PFS、DMFS和RFS差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 LMP-1陰性組和陽性組以及CXCR4弱染色組和強染色組的鼻咽癌患者生存情況比較

3 討論

鼻咽癌是南方地區(qū)高發(fā)惡性腫瘤，與EB病毒感染密切相關，而LMP-1是EB病毒潛伏感染時表達的一種重要轉化膜蛋白,其與細胞的轉化、增殖、去分化以及腫瘤的生長轉移有關[16]。既往國內(nèi)研究報道采用免疫組化方法檢測LMP-1在鼻咽癌組織中的陽性表達率為43%～72.5%[17-18]，采用PCR檢測LMP-1陽性表達率更高，可達88.37%[19]。目前該研究采用免疫組化檢測LMP-1陽性率達75.76%，與文獻報道結果一致。LMP-1蛋白表達與病理類型是否有關存在爭議[19-20]。該研究結果顯示：鼻咽未分化型非角化性癌占84.85%，分化型非角化性癌占15.15%。雖然LMP-1在未分化組表達略高于分化組(76.79% vs.70%)，但差異未達到統(tǒng)計學意義。LMP-1蛋白表達與性別、年齡、臨床分期、T分期、鼻咽腫瘤體積、淋巴結壞死和融合無關，但與N分期、頸部轉移淋巴結體積有關。LMP-1在N0～1期、N2和N3期患者中陽性表達率為56.25%、75%和90.91%，呈遞增趨勢，并且頸部轉移淋巴結體積越大，LMP-1表達率越高。分析LMP-1與遠處轉移、復發(fā)關系發(fā)現(xiàn)：LMP-1與遠處轉移有關，與鼻咽癌局部復發(fā)無關，遠處轉移組LMP-1陽性率高。LMP-1陰性組總生存率、無進展生存率和無遠處轉移生存率顯著高于陽性組，但無復發(fā)生存率兩組無顯著性差異。本研究結論與Zhao等[21]的研究結果一致，林錦等[19]研究發(fā)現(xiàn)淋巴結陽性組(N1～3)患者LMP-1 陽性表達率明顯高于淋巴結陰性組(N0)。首診無遠處轉移(M0)患者122例中有107例LMP-1呈陽性表達，陽性表達率為87.70%，而首診有遠處轉移(M1)的7例患者LMP-1均呈陽性表達，陽性表達率為100%，高于M0組，但該研究分析遠處轉移組與無遠處轉移組LMP-1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義，考慮與該研究隨訪時間過短有關。

目前關于LMP-1蛋白表達與腫瘤體積的關系無人報道，該研究中淋巴結體積大于49.15 cm3組的LMP-1陽性表達率高，盡管LMP-1在鼻咽部腫瘤不同體積組(GTVp≥59 cm3和GTVP<59 cm3)表達差異無統(tǒng)計學意義，但在大體積組仍表現(xiàn)出增高趨勢(85.71% vs.71.11%)。由此提示：LMP-1具有促進鼻咽癌腫瘤細胞生長和轉移的作用，可作為預測鼻咽癌預后的生物學指標。那么LMP-1是如何促進腫瘤生長和轉移呢？其內(nèi)在機制目前尚不十分明確。趨化因子受體4(CXCR4)在腫瘤細胞中高表達，其配體即趨化因子基質細胞衍生因子1(Stromal cell derived factor 1,SDF-1)是一種趨化蛋白，在骨、肺、肝、腦等腫瘤易轉移器官中高表達。CXCR4 與SDF-1 具有高度親和力，兩者特異性結合構成SDF-1/CXCR4 軸參與腫瘤細胞增殖、浸潤和定向遷移等[22-23]?，F(xiàn)有研究表明，LMP-1可以通過激活NF-KB信號通路，從而促進腫瘤轉移[14]，而另有研究報道NF-KB信號通路可上調CXCR4表達增加，促進腫瘤細胞的遷移和轉移[15]。然而LMP-1、CXCR4兩者是否具有相關性呢?

Li等[24]采用免疫組化檢測56例鼻咽癌患者鼻咽腫瘤CXCR4陽性表達率為30%，Segawa等[12]的報道中CXCR4陽性率為53.9%。Hu等[25]采用PCR、免疫組化法和流式細胞儀等方法檢測CXCR4在鼻咽癌中的陽性表達率為77.5%。Wang等[26]采用免疫組化檢測194例鼻咽癌腫瘤組織CXCR4表達，結果發(fā)現(xiàn)：194例中僅1例不染色，強陽性表達率為45.4%(88例)，弱陽性表達率為54.12%(105例)，不表達1例。在鼻咽癌的不同研究中CXCR4陽性表達率不同，可能與檢測方法以及陽性評判標準存在差異有關。Wang等[26]分析CXCR4表達與預后的關系發(fā)現(xiàn)：CXCR4強表達中有38.6%的遠處轉移率，弱或陰性表達者僅19.8%發(fā)生遠處轉移。CXCR4強表達組的生存率低于弱表達組。該研究采用免疫組化檢測66例鼻咽腫瘤組織CXCR4的表達，結果發(fā)現(xiàn)僅1例未達到陽性診斷標準，弱染色有16例，強染色50例。根據(jù)染色強弱進行分組分析，結果未發(fā)現(xiàn)CXCR4染色強弱與臨床病理、復發(fā)和轉移等有關，LMP-1表達與CXCR4染色強弱亦不存在相關性。

綜上所述，LMP-1陽性者，更容易發(fā)生轉移，可作為腫瘤治療的分子靶點和預測鼻咽癌預后的生物學指標。CXCR4在鼻咽癌組織中的表達及其意義需要進一步探索。