張辰銘 王東君 孫春陽

乳腺癌是最常見的婦科癌癥之一，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌高致死率的主要原因。雖然已經(jīng)開發(fā)了多種治療人乳腺癌的方法，但乳腺癌患者的死亡率仍未下降[1]。因此，急需研究新的更有效的治療策略。研究報道，12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)是一種癌癥啟動因子，其誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生與細胞上皮細胞增殖并向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。矛盾的是，TPA也是一種有效的細胞凋亡刺激因子，在7種人細胞中可激活至少26種蛋白，包括MAPK、PKC同工酶等[3]。多項研究表明TPA可通過釋放細胞色素C誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞和骨髓性白血病細胞等多種細胞凋亡[4]，但對乳腺癌細胞的作用還鮮少報道。早前的研究表明，TPA可通過上調(diào)Bax誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡。然而，TPA誘導(dǎo)細胞凋亡的具體分子機制尚不清楚。TR3(也稱為Nur77和NR4A1)已成為腫瘤細胞存活的主要調(diào)節(jié)因子和潛在治療靶標，參與多種化學(xué)治療藥物介導(dǎo)的各種癌細胞的凋亡[5]。已知TR3誘導(dǎo)細胞凋亡的機制主要包括釋放細胞色素C、上調(diào)促凋亡基因和/或下調(diào)抗凋亡基因[5]。然而，TR3是否介導(dǎo)TPA對乳腺癌細胞的凋亡仍不清楚。本研究旨在研究TPA對乳腺癌細胞增殖、凋亡及線粒體功能的影響，并探討TR3是否介導(dǎo)TPA對乳腺癌細胞功能的調(diào)控作用，為乳腺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系MCF-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫，將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞干預(yù)

將細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，分別采用2.5 nM和10 nM的TPA(美國Sigma-Aldrich公司)干預(yù)細胞48 h，之后用于后續(xù)檢測。對照組用DMSO干預(yù)。

1.3 細胞增殖抑制率檢測

將20 μl 5 mg/ml的MTT溶液加入至干預(yù)48 h后的細胞中，孵育4 h，用酶標儀在570 nm處讀取吸光值(A)。以只加培養(yǎng)基的孔作為空白對照。細胞增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A空白組)×100%。

1.4 細胞凋亡檢測

收獲干預(yù)48 h后的細胞，采用Annexin V/PI Cell Apoptosis Detection Kit試劑盒對細胞進行染色(南京KeyGen Biotech公司)。采用FACS Calibur流式細胞儀及Cell-Quest軟件獲取及分析數(shù)據(jù)。

1.5 Western Blot

采用RIPA裂解液從干預(yù)48 h后的細胞中提取總蛋白，經(jīng)定量后取30 g的總蛋白加入上樣緩沖液中，用10% SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%胎牛血清封閉45 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光試劑在暗室發(fā)光。采用美國Bio-Rad公司提供的Quantity One 4.6.2軟件分析及處理條帶。抗體均購自美國Abcam公司。pro-caspase-9和cleaved-caspase-9檢測內(nèi)參用-actin。

采用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit試劑盒(加拿大BioVision公司)分別提取細胞核和細胞質(zhì)中的總蛋白，用Western Blot檢測細胞核和細胞質(zhì)(含線粒體)中TR3蛋白的表達。細胞質(zhì)中TR3檢測內(nèi)參用Tubulin，細胞核中TR3檢測內(nèi)參用Lamin A。

采用線粒體分離試劑盒(南京KeyGen Biotech公司)分離線粒體，用Western Blot檢測線粒體和細胞質(zhì)(不含線粒體)中TR3蛋白的表達。線粒體中TR3檢測內(nèi)參用VDAC1，細胞質(zhì)中TR3檢測內(nèi)參用Tubulin。

1.6 流式細胞儀

采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(上海碧云天公司)檢測干預(yù)48 h后的細胞線粒體膜電位，用FACS Calibur流式細胞儀及Cell-Quest軟件獲取及分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用FL2/FL1(紅/綠熒光強度)的比值表示。將10 mM Fluo-3 AM(上海碧云天公司)裝載于干預(yù)48 h后的細胞，用于細胞中Ca2+水平的檢測，37 ℃暗室孵育30 min后用FACS Calibur流式細胞儀在Ex./Em.為488/525 nm時檢測熒光強度。

采用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天公司)檢測干預(yù)48 h后的細胞中ROS水平，將細胞用二氫二氯熒光素(DCFH-DA)探針在37 ℃暗室孵育30 min后，用FACS Calibur流式細胞儀檢測熒光強度。

1.7 生物信息學(xué)檢測

采用UALCAN軟件(http://ualcan.path.uab.edu/)分析TR3在正常人和乳腺癌患者中的表達。采用Kaplan Meier-plotter[Breast Cancer]軟件(http://kmpl ot.com/analysis/)檢測TR3對乳腺癌患者總體生存率的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TPA對乳腺癌細胞增殖抑制率的影響

對照組細胞增殖抑制率為(0.94±0.12)%，2.5TPA組為(16.07±2.68)%、10TPA組為(37.65±4.92)%。與對照組相比，2.5TPA組和10TPA組細胞增殖抑制率顯著增加(F=130.06，P<0.001)，對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 TPA對乳腺癌細胞凋亡的影響

如表1所示，與對照組相比，2.5TPA組和10TPA組細胞凋亡率和cleaved-caspase-9蛋白表達顯著增加(P<0.05)，pro-caspase-9蛋白表達無顯著變化(P>0.05)。

表1 各組細胞凋亡對比

2.3 TPA對乳腺癌細胞線粒體功能的影響

如表2所示，與對照組相比，2.5TPA組和10TPA組細胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，Ca2+水平和ROS水平顯著增加，對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組細胞線粒體功能對比

2.4 TPA對TR3線粒體靶向的影響

如表3所示，與對照組相比，2.5TPA組和10TPA組細胞核和細胞質(zhì)(不含線粒體)中TR3蛋白的表達顯著降低(P<0.05)，而細胞質(zhì)(含線粒體)和線粒體中TR3蛋白的表達顯著增加，對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組細胞組分中TR3表達對比

2.5 TR3對乳腺癌患者臨床結(jié)局的影響

如圖1所示，與正常人相比，TR3在乳腺癌患者中的表達顯著降低(P<0.05)。與TR3低表達的乳腺癌患者相比，TR3高表達的乳腺癌患者總體生存率顯著增加(P<0.05)。

注：*P<0.05，與對照組比較。

3 討論

眾所周知，TPA是一種腫瘤啟動因子，其可通過激活蛋白激酶C(PKC)誘導(dǎo)腫瘤細胞侵襲[6]。然而，矛盾的是TPA又可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[7]。這樣的矛盾點表明TPA在腫瘤中的作用需要進一步研究。本研究旨在研究TPA對乳腺癌細胞凋亡的影響，并探討其分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5 nM和10 nM的TPA均可抑制人乳腺癌細胞MCF-7的細胞增殖，促進其凋亡。此外，還觀察到TPA作用48 h后，可明顯觀察到caspase-9裂解。在線粒體凋亡通路中，caspase-9募集細胞色素C和Apaf-1而激活，完整的caspase-9激活后裂解為活性片段，進而激活其下游底物caspase-3，啟動線粒體凋亡通路[8]，因此caspase-9裂解物的表達增加表示caspase-9激活，線粒體凋亡通路激活。這些結(jié)果證實，TPA可抑制乳腺癌細胞增殖，促進乳腺癌細胞凋亡，凋亡機制可能與線粒體凋亡通路的啟動有關(guān)。

線粒體凋亡途徑常伴有線粒體功能障礙[9]，為進一步驗證線粒體功能障礙是否介導(dǎo)TPA導(dǎo)致乳腺癌細胞凋亡過程，我們采用流式細胞儀檢測2.5 nM和10 nM的TPA干預(yù)48 h后細胞線粒體膜電位、Ca2+水平和ROS水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5 nM和10 nM的TPA均可顯著降低乳腺癌細胞線粒體膜電位，增加Ca2+水平和ROS水平。線粒體膜電位降低，導(dǎo)致線粒體膜通道孔(mPTP)開放，引起線粒體內(nèi)鈉、鉀、鈣等離子平衡失調(diào)，而高Ca2+水平又可進一步刺激mPTP的開放，最終導(dǎo)致線粒體功能紊亂及結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細胞死亡[10]。而TPA導(dǎo)致ROS水平的增加，是過度氧化應(yīng)激的表現(xiàn)，也可進一步刺激mPTP的開放，導(dǎo)致細胞死亡[10]。這些結(jié)果表明，TPA誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂可能是其引起細胞凋亡的機制之一。

靶向促凋亡因子TR3已成為一種新的癌癥治療策略，TR3介導(dǎo)的細胞凋亡主要是將TR3從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)而引起的，最終導(dǎo)致線粒體中細胞色素C釋放。細胞色素C是內(nèi)源性凋亡通路的核心介導(dǎo)因子，當(dāng)大量的細胞色素C釋放進入細胞質(zhì)后，將啟動下游caspase的瀑布式激活而誘發(fā)凋亡。因此TR3由細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)是細胞凋亡的啟動因素。為探討TR3在TPA誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用，我們檢測TPA對乳腺癌細胞核、細胞質(zhì)和線粒體中TR3蛋白表達的影響，結(jié)果顯示2.5 nM和10 nM的TPA顯著降低細胞核和細胞質(zhì)(不含線粒體)中TR3蛋白的表達，增加細胞質(zhì)(含線粒體)和線粒體中TR3蛋白的表達，提示TPA可促進TR3由細胞核向細胞質(zhì)中線粒體轉(zhuǎn)運，是導(dǎo)致細胞色素C介導(dǎo)的線粒體凋亡的前提條件。此外，我們的研究表明，TR3在乳腺癌患者中低表達，且其高表達可顯著增加乳腺癌患者的總體生存率(OS)，因此，TR3可用作乳腺癌治療的新靶標。

總之，TPA誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡取決于TR3蛋白的表達，分子機制是促進TR3核輸出并定位于線粒體，從而引起線粒體凋亡，這進一步表明TR3是乳腺癌治療的潛在靶標。