范培軍 王志堅(jiān) 仲 濤

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移容易、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]，手術(shù)與化療是其主要治療方法[2]。順鉑(Cisplatin，CDDP)、甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、阿霉素(Doxorubicin，DOX)是臨床上應(yīng)用最多的骨肉瘤化療藥物，但長時(shí)間應(yīng)用后會(huì)對(duì)正常組織和器官產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用[3-4]。TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子，也為一種Ⅱ型跨膜蛋白，可通過與死亡受體的相互作用，從而活化Caspase蛋白酶家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。當(dāng)前研究表明TRAIL與化療藥物合用，可提升腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性[6-7]。本文具體探討了TRAIL對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U-2OS凋亡與增殖的影響，以明確TRAIL的作用效果與機(jī)制?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要研究材料

骨肉瘤U-2OS細(xì)胞株購自湖北武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于含15%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基混合液內(nèi)，采用37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。阿霉素(法瑪西亞普強(qiáng)公司)、DMEM培養(yǎng)基(Gibeo公司)、人可溶性TRAIL蛋白(上海廣瀾生物工程公司)。

1.2 細(xì)胞分組與處理

取處于生長對(duì)數(shù)期細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞，隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、阿霉素組與聯(lián)合組，每組(3～5)×105個(gè)細(xì)胞/ml。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，以PBS代替藥物處理；阿霉素組采用100 μg/ml的阿霉素處理，聯(lián)合組在阿霉素組處理的基礎(chǔ)上采用1 000 ng/ml的TRAIL處理。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

把處理后的細(xì)胞制成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每孔加入20 μl MTT染液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加150 μl DMSO，震蕩15 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.4 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)

細(xì)胞處理后經(jīng)過消化離心，用4 ℃預(yù)冷的無菌PBS漂洗細(xì)胞2遍，用250 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml，取200 μl的細(xì)胞懸液加入10 μl的Annexin聯(lián)膜蛋白V-異硫氰酸熒光素，然后加入10 μl濃度20 μg/ml的碘化丙錠，室溫避光孵育10 min，加入500 μl PBS后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞處理后經(jīng)過消化離心，重懸細(xì)胞，1500 rpm離心5 min，棄凈上清，加入1 ml冰預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜；PBS重懸細(xì)胞，1 500 rpm離心5 min洗去乙醇；每管加入500 μl碘化丙啶染色液，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理后收獲細(xì)胞，裂解并提出蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，上樣20 μg蛋白，利用SDS-PAGE電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，通過5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉處理，時(shí)長1 h，然后加入1∶1 000稀釋的一抗(抗Caspase-3抗體、抗β-actin抗體)，然后放入到搖床中進(jìn)行孵育，環(huán)境設(shè)置為4 ℃，時(shí)長為12 h，TBST清洗3次，每次10 min，然后加入1∶5 000稀釋的二抗，再重復(fù)以上清洗，最后采用超敏ECL試劑暗室曝光檢測(cè)蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)對(duì)比

處理后24 h和48 h，相比于對(duì)照組，阿霉素組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)，阿霉素組與聯(lián)合組間的對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組處理后細(xì)胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)對(duì)比

2.2 細(xì)胞周期對(duì)比

處理后48 h，相比于對(duì)照組，阿霉素組與聯(lián)合組的G0/G1期比例顯著降低(P<0.05)，S期和G2/M期比例顯著增加(P<0.05)，阿霉素組與聯(lián)合組間的對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組處理后48 h細(xì)胞周期對(duì)比

2.3 蛋白表達(dá)對(duì)比

處理后24 h和48 h，相比于對(duì)照組，阿霉素組與聯(lián)合組的Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，阿霉素組與聯(lián)合組間的對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3與圖1。

表3 3組處理后Caspase-3蛋白表達(dá)對(duì)比

圖1 3組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的Caspase-3蛋白

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，是骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征，多發(fā)于青少年，血行轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，進(jìn)展迅速，因此患者的預(yù)后比較差[8]。阿霉素目前仍然是臨床上治療骨肉瘤的主要化療藥物，但是單一用藥很難見效，目前多采用多種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用來治療骨肉瘤[9-10]。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子超家族成員之一，可通過與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞的毒性較低[11]。TRAIL具有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，能有效傳遞凋亡信號(hào)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)TRAIL濃度較低時(shí)，TRAIL 能與誘導(dǎo)受體競(jìng)爭性結(jié)合，為此對(duì)細(xì)胞的殺傷作用還不夠明顯；而當(dāng)TRAIL濃度較高時(shí)，TRAIL可與死亡受體結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。本研究顯示處理后24 h和48 h，相對(duì)于對(duì)照組，阿霉素組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，阿霉素組與聯(lián)合組對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TRAIL的加入能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

隨著化療方案臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)理論研究的不斷深入，臨床上已有多種因素可影響骨肉瘤的化療療效。TRAIL最主要的生物學(xué)特點(diǎn)是只能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而不能誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡[14]。細(xì)胞周期指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束至下一次分裂完成所經(jīng)歷的時(shí)期，分為G0期、G1期、G2期、S期，在一系列周期蛋白的調(diào)控下，細(xì)胞周期得以正常有序的進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞周期出現(xiàn)異常情況時(shí)，如DNA損傷、DNA復(fù)制受阻時(shí)，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)將被激活，及時(shí)中斷細(xì)胞周期運(yùn)行并進(jìn)行修復(fù)；但是如果修復(fù)失敗，細(xì)胞將啟動(dòng)凋亡程序[15]。本研究顯示處理后48 h，相對(duì)于對(duì)照組，阿霉素組與聯(lián)合組的G0/G1期比例顯著降低，S期和G2/M期比例顯著增加，阿霉素組與聯(lián)合組對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TRAIL的加入能降低G0/G1期細(xì)胞比例。

當(dāng)前骨肉瘤的治療有了很大的發(fā)展，但是傳統(tǒng)化療藥的毒副作用及耐受性限制了其應(yīng)用，因此調(diào)整化療藥物劑量以及合理選擇輔助治療藥物已成為抗腫瘤研究的重要方向[16]。TRAIL與死亡受體DR4及DR5特異性結(jié)合并誘發(fā)其活化，可催化形成活化的Caspase-3，進(jìn)一步進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的Caspases因子，最終誘發(fā)凋亡[17-18]，并且TRAIL可促使Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體膜上，使線粒體膜通透性增強(qiáng)，釋放大量促凋亡分子[19-20]。本研究顯示處理后24 h和48 h，相對(duì)于對(duì)照組，阿霉素組與聯(lián)合組的Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著增加，阿霉素組與聯(lián)合組對(duì)比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TRAIL的加入能促進(jìn)Caspase-3蛋白的表達(dá)。本研究也存在一定的不足，沒有進(jìn)行動(dòng)物模型分析，且Caspase-3的作用信號(hào)通路分析還不夠深入，將在后續(xù)研究中進(jìn)行進(jìn)一步分析。

總之，TRAIL在骨肉瘤細(xì)胞中的應(yīng)用能促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)，降低G0/G1期細(xì)胞比例，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。