邱 楊 駱 萍 吳書貴 鐘曉鳴

結腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。大多數(shù)轉移性結直腸癌患者仍無法治愈，結腸癌聯(lián)合化療的陽性反應率僅為20%～47%，大多數(shù)患者容易復發(fā)[2]。順鉑廣泛用于多種癌癥的治療[3]，然而經常在給藥一段時間有效反應后常出現(xiàn)耐藥，其具體機制仍不清楚[4]。有研究表明長非編碼RNA(LncRNA)與染色質調節(jié)蛋白、RNA結合蛋白和小RNA相互作用形成功能復合物，調節(jié)多個重要的生命過程[5]。為了研究LncRNA MIR4435-2HG在順鉑耐藥中的作用，破壞了順鉑耐藥細胞株HCT-116R中MIR44535-2HG的表達，這些耐藥細胞株又對順鉑變得敏感，同時發(fā)現(xiàn)mRNA中Nrf2和HO-1表達水平也下降了。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和試劑

結腸癌細胞株HCT-116購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(Manassas，VA，USA)，從HCT-116對順鉑敏感的細胞株中建立順鉑耐藥HCT-116R細胞株。HCT-116和HCT-116R細胞株在McCoy's 5A培養(yǎng)基(Gibco，Life Technologies，USA)中以單層保持，McCoy's 5A培養(yǎng)基主要在37 ℃加濕5%CO2環(huán)境中，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)。MIR4435-2HG siRNA購自中國Thermo Fisher，用Lipofectamine 2000轉染劑進行siRNA轉染。

1.2 細胞增殖試驗

使用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(購置日本)，通過WST-8測定評估細胞增殖。將HCT-116細胞株接種在96孔板中并孵育24 h。并將細胞株分別于加或不加25 μm順鉑在McCoy's 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每個處理為一式三份進行。孵育后向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑，并將板放在37 ℃含5%CO2環(huán)境中孵育4 h，然后用酶標儀在450 nm的波長處測量光密度。

1.3 總RNA分離和實時熒光定量PCR分析

根據(jù)說明，使用TrizolReagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)從處理的細胞中分離總RNA。通過分光光度計(Beckman，Brea，CA)和凝膠電泳分別測定RNA濃度和質量。使用總體積20 ml的M-MLV逆轉錄酶試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成第1條cDNA鏈。使用SYBR Green一式三份進行基因表達實時熒光定量(qRT-PCR)分析。使用的引物序列是MIR4435-2HG正向：5'-CGGAGCATGGAACTCGACAG-3'，MIR4435-2HG反向：5'-CAAGTCTCACACATCCGGGC-3;Nrf2正向：5'-TACTCCCAGGTTGCCCACA-3'，Nrf2反向：5'-CATCTACAAACGGGAATGTCTGC-3 ';HO-1正向：5'-CACGCATATACCCGCTACCT-3'，HO-1反向：5'-AAGGCGGTCTTAGCCTCTTC-3';GAPDH正向：5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，GAPDH反向：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'。

1.4 Caspase-3活性測定

將細胞以5000的密度接種到96孔板中并使其生長24 h。然后根據(jù)說明書用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，China)轉染靶向MIR4435-2HG的siRNA，24 h后收集細胞，用Caspase-3 Assay Kit(比色法)測定半胱天冬酶活性(Abcam ab39401，Cambridge，UK)。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)值表示為均值±標準差，使用Prism Graphpad 6.0進行統(tǒng)計學分析，P<0.05時統(tǒng)計學存在顯著性差異。

2 結果

2.1 HCT-116、HCT-116R細胞株對順鉑的敏感性及MIR4435表達水平

首先，我們通過3個月在HCT-116中添加25 μm順鉑來誘導HCT-116對順鉑的耐藥性，我們將其命名為HCT-116R。HCT-116R細胞株可以在25 μm順鉑的情況下增殖，而大多數(shù)HCT-116敏感細胞逐漸死亡(圖1A)。通過檢測對順鉑的反應，然后使用RNA-Seq分析HCT-116和HCT-116R的改變的細胞轉錄組，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MIR4435-2HG水平顯著增加了約10倍，并且結果通過實時熒光定量PCR的驗證(圖1B)。

注：A，用25 μm順鉑處理HCT116和HCT116R細胞，并在0，8和24 h后通過WST測定測試細胞活力。B，通過實時熒光定量PCR檢測HCT-116和HCT-116R中的lncRNA MIR4435-2HG水平。

2.2 敲除MIR4435-2HG的HCT-116R對順鉑的敏感性

為了研究LncRNA MIR4435-2HG與順鉑耐藥性的關系，我們通過siRNA敲除siRNA HCT-116R的LncRNA MIR4435-2HG，并且通過實時熒光定量PCR驗證了siRNA的MIR4435-2HG水平顯著降低(圖2A)。通過siRNA敲除MIR4435-HG2增加HCT-116R對順鉑的敏感性，并且通過WST測定測試細胞活力，在存在25 μm順鉑的情況下，針對MIR4435-2HG的siRNA抑制HCT-116R的增殖，而siRNA的堿基錯配序列沒有顯著影響(圖2B)。敲除MIR4435-2HG后，順鉑使casepase-3活性增加約2倍(圖2C)，這也表明HCT-116R的凋亡。

注：A.通過siRNA在HCT116R中敲除lncRNA MIR4435-2HG，并通過實時熒光定量PCR驗證siRNA的作用。B.通過siRNA敲除MIR4435-HG2增加HCT-116R對順鉑的敏感性，并且在順鉑給藥后0，8和24 h通過WST測定測試細胞活力。C在順鉑治療后24 h后測試casepase-3活性。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。

2.3 敲除MIR4435-2HG對與氧化損傷相關Nrf2和HO-1的mRNA水平的影響

轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf2)是細胞防御化學/氧化應激的重要調節(jié)因子，血紅素加氧酶-1(HO-1)是Nrf2調節(jié)基因，在預防炎癥中起關鍵作用。在25 μm順鉑處理后，MIR4435-2HG siRNA的轉染顯著下調了Nrf2和HO1的mRNA水平(圖3)，表明MIR4435-2HG的作用涉及氧化應激。

注：通過實時熒光定量PCR分析了HCT-116R細胞的相對NRF2(A)和HO-1 mRNA(B)水平，并將結果標準化為參考基因GAPDH。*P<0.05。

3 討論

順鉑被認為可以與DNA中的一些堿基形成共價復合物，然后治愈許多睪丸和一些卵巢癌癥[6]。然而，順鉑在結直腸癌的治療中有效率較低，單獨使用或與其他抗癌藥物聯(lián)合使用時臨床反應不到20%[7]。最近一些研究表明，lncRNA通過各種不同的機制導致了順鉑耐藥[8]。據(jù)報道，LncRNA MIR4435-2HG與肝細胞癌[9]和肺癌有關[10]。Ouyang等發(fā)現(xiàn)LncRNA-MIR4435-2HG可能通過P38/MAPK和VEGF途徑參與結直腸癌的發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常細胞株相比，順鉑耐藥細胞株中LncRNA MIR4435-2HG水平增加了7～8倍，這表明MIR4435-2HG可能涉及順鉑耐藥。然后我們用siRNA敲低MIR4435-2HG水平，在順鉑耐藥HCT-116R的細胞中，siRNA抑制約90%的MIR4435-2HG表達。在HCT-116R細胞株中敲除 MIR4435-2HG在順鉑給藥24 h導致約1/3的HCT-116R死亡，在對照組中，沒有MIR4435-2HG表達破壞的HCT-116R細胞株在24 h增殖約2倍。除此之外，在順鉑處理24 h后，與HCT-116R細胞相比，MIR4435-2HG敲除細胞中caspase-3活性增加2.5倍。而siRNA的堿基錯配序列沒有顯著影響，這表明順鉑誘導的細胞死亡可能主要由細胞凋亡產生。

轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf2)是一種轉錄因子，對氧化應激反應并在氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[12]。血紅素加氧酶(HO)作為Nrf2的下游[13]，是一種催化血紅素降解的酶[14]。這兩種成分通常在不同類型的腫瘤中表達增加，并與腫瘤進展、侵襲性及對治療的耐藥和預后不良相關[15]。本研究中，MIR4435-2HG的敲除顯著降低了NRF2和HO-1 的mRNA水平。

綜上，本研究觀察到lncRNA MIR4435-2HG為驅動HCT-116細胞株的順鉑耐藥的主要因子。此外，lncRNA MIR4435-2HG可能通過Nrf2/HO-1途徑參與順鉑耐藥的發(fā)生。本研究揭示了lncRNA MIR4435-2HG在結直腸癌順鉑耐藥中的作用，并提供了順鉑耐藥的潛在機制?；陧樸K耐藥的機制，通過以下策略來克服未來結直腸癌的耐藥性：①開發(fā)新的鉑類藥物;②改善順鉑向腫瘤的遞送方式；③特異性靶向順鉑耐藥機制；④將順鉑與其他藥物結合起來。