吳 江 吳 濤 陳 鵬 龐 瀾 阿里木江·阿不都熱合曼 馬秀英 包 輝 朱勇荷 岳躍明 張荔霜

胃癌作為消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病，病死率逐年遞增，已成為惡性腫瘤死亡的第二主要病因[1]。既往研究指出，胃癌的發(fā)生發(fā)展與胃黏膜組織上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及原癌基因的激活密切相關(guān)[2]。臨床上，胃癌的預(yù)防及治療目標(biāo)是減輕黏膜病變、抑制細(xì)胞凋亡并修復(fù)受損細(xì)胞，從而逆轉(zhuǎn)癌變進(jìn)展[3]。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)作為一種候選抑癌基因，參與了機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)移具有抑制作用，同時(shí)還可阻斷細(xì)胞因子的合成分泌，阻止腫瘤的形成[4]。P53基因失調(diào)或突變可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性增生、加速癌變進(jìn)展。有研究證實(shí)腫瘤組織中P53基因突變或失調(diào)高達(dá)50%，在胃黏膜病變中可反映上皮細(xì)胞增生的程度[3,5]。生存素(Survivin)是至今發(fā)現(xiàn)的最具有代表性的凋亡抑制基因，在細(xì)胞異常增生過(guò)程中表達(dá)明顯上調(diào)，可作為腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)癌變程度[5]。胃竇黏膜蛋白-18(AMP-18或稱為Gastrokine-1)是一種胃黏膜保護(hù)蛋白，在維持胃黏膜細(xì)胞有絲分裂等正常生理功能中具有重要意義，然而在癌變組織中表達(dá)下調(diào)[6]。Syk、P53、Survivin及AMP-18等物質(zhì)在腫瘤疾病中均有突變或表達(dá)異常，但與胃癌的進(jìn)展分期或癌變程度是否有一定相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在分析大鼠胃黏膜組織中Syk、P53、Survivin及AMP-18 mRNA的表達(dá)和胃癌病變程度的相關(guān)性，以幫助胃癌早期診斷及治療預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠48只，體重180～200 g，鼠齡約4個(gè)月，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2011-0003)。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、吐溫20、維生素D3均購(gòu)自上海麥恪林生化科技有限公司。RT-PCR 兩步法試劑盒(TaKaRa生物工程有限公司)。GAPDH、Syk和Survivin等兔抗大鼠一抗購(gòu)自美國(guó)Abcom公司；細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)蛋白試劑盒購(gòu)買(mǎi)于武漢碧云天有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑、氯仿、無(wú)水酒精、異丙醇均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模

將48只SD大鼠(180～200 g)分為A、B、C、D 4組。A組給予生理鹽水作為對(duì)照組，并于第24周處死取材。B組、C組和D組參照文獻(xiàn)方法采用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)誘導(dǎo)建立大鼠胃癌模型[6-7]，具體步驟如下：1～8周給予大鼠自由飲水，水中的MNNG溶液濃度為100 μg/ml的(內(nèi)含4 mg/l吐溫20和20 mg/l的維生素D3)；9～16周MNNG溶液濃度增加至150 μg/ml，17～24周MNNG溶液濃度為180 μg/ml，分別于第8周(B組)、第16周(C組)及第24周(D組)處死大鼠取材。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 胃黏膜組織病理切片評(píng)估 用過(guò)量水合氯醛(1 g/kg)深度麻醉處死大鼠，解剖取胃黏膜組織。每組取4只大鼠胃組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，行石蠟包埋常規(guī)切片(4 μm)。然后采用蘇木精伊紅染液行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜組織細(xì)胞病理學(xué)改變，比較各組大鼠胃黏膜病理?yè)p傷情況。

1.3.2 免疫印跡法檢測(cè)大鼠胃黏膜Syk和Survivin蛋白表達(dá) 解剖腹部取胃，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水清洗后，肉眼仔細(xì)觀察胃黏膜變化，取一定量的胃黏膜組織，采用1%的苯甲磺酰氟(PMSF)裂解液(胃黏膜組織和裂解液以1∶10質(zhì)量比勻漿)提取蛋白樣品，10 000 rpb離心10 min(4 ℃)。吸取上清液測(cè)定總蛋白含量(BCA試劑盒)，計(jì)算后采用裂解液稀釋樣品將蛋白調(diào)至同一濃度。加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min使蛋白質(zhì)變性，冷卻后-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μl樣品上樣，通過(guò)10%SDS-P聚丙酰胺凝膠電泳跑膠分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜。分別加入β-actin(1∶3000)、Syk和Survivin蛋白(1∶500，美國(guó)Abcam)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗室溫孵育后，ECL法曝光顯影獲得蛋白條帶。

1.3.3 Q-PCR檢測(cè)P53和AMP-18 mRNA水平 取各組胃黏膜組織35 mg，利用TRizol法提取總RNA，檢測(cè)濃度并取10 μl的總RNA，根據(jù)cDNA Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，Q-PCR)檢測(cè)P53和AMP-18 mRNA的水平；反應(yīng)體系總體積10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，正反向引物(10 μmol/l)各0.5 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，擴(kuò)增循環(huán)40次；最后一個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃延伸15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參測(cè)定P53和AMP-18 mRNA水平；定量PCR特異產(chǎn)物通過(guò)溶解曲線分析，以2-ΔΔCT表示相對(duì)基因表達(dá)變化。PCR引物序列見(jiàn)表1(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司)。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃黏膜組織細(xì)胞病理改變

HE病理染色(均為400 ×)結(jié)果顯示，A組大鼠胃黏膜完整正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且黏膜層、黏膜下層、肌層及外膜層等結(jié)構(gòu)清晰可辨；B組大鼠胃黏膜組織和A組相似，黏膜腺體結(jié)構(gòu)基本正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞；C組大鼠胃黏膜局部有破損，基底部部分腺體細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞核明顯增大，有輕度異型性，提示胃癌早期；D組大鼠胃黏膜局部破損增加，黏膜下層及肌層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分腺體擴(kuò)張，核質(zhì)比增大，為胃癌進(jìn)展期。

2.2 大鼠胃黏膜Syk和Survivin蛋白表達(dá)情況

本研究結(jié)果表明(如圖1所示)，與A組比較，B組、C組和D組大鼠胃黏膜組織Syk蛋白水平明顯下降(P<0.05)，且D組較B組進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B(niǎo)組、C組和D組大鼠胃黏膜組織Survivin蛋白表達(dá)則逐漸遞增(P<0.05)，且C組、D組與A、B組均有顯著性差異(P<0.05)。

注：*為與A組比較，P<0.05；#為與B組比較，P<0.05。

2.3 大鼠胃黏膜組織P53和AMP-18 mRNA表達(dá)

B組、C組和D組大鼠胃黏膜組織P53表達(dá)逐漸增加，且C組、D組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而B(niǎo)組、C組和D組大鼠胃黏膜組織AMP-18 mRNA水平逐漸下降(P<0.05)，C組、D組與A組有顯著性差異(P<0.05)。D組P53和AMP-18 mRNA水平與B組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織P53和AMP-18 mRNA表達(dá)

3 討論

既往病理學(xué)研究指出[8]，胃癌病變的進(jìn)展特點(diǎn)為：癌組織浸潤(rùn)若位于黏膜下層以內(nèi)，不論累及、病變范圍多大或淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移均屬早期胃癌；但癌組織浸潤(rùn)至肌層或更多則為進(jìn)展期胃癌，表明胃癌病變加重。本文采用MNNG方法造模，HE病理染色觀察到不同時(shí)期胃癌病變的進(jìn)程，8周左右B組大鼠胃黏膜組織幾乎和A組正常大鼠一樣，基本無(wú)病變；16周C組大鼠胃黏膜基底部部分腺體細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞核增大，有輕度異型性，證實(shí)為胃癌早期；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，24周D組大鼠胃黏膜下層及肌層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核質(zhì)比明顯增大，為胃癌進(jìn)展期。本研究成功構(gòu)建了不同時(shí)期的胃癌病變過(guò)程，有助于幫助探究大鼠胃黏膜組織Syk、Survivin、P53及AMP-18 mRNA表達(dá)和胃癌病變程度的相關(guān)性。

Syk、Survivin、P53基因等作為腫瘤細(xì)胞增生、凋亡等抑制基因，在機(jī)體免疫反應(yīng)、癌變細(xì)胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[3-5,9]，而AMP-18在維持胃黏膜細(xì)胞正常生理功能中具有重要意義[6]，國(guó)外學(xué)者報(bào)道其在癌變組織中表達(dá)是降低的[10]。胃癌的病變發(fā)展是多階段的，了解胃黏膜正常細(xì)胞發(fā)展到癌細(xì)胞過(guò)程中Syk、Survivin、P53及AMP-18表達(dá)是如何變化的對(duì)深入研究不同階段的病因機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。目前，Syk、Survivin、P53及AMP-18等物質(zhì)在胃癌病變程度中的表達(dá)情況，及其與胃癌的進(jìn)展分期或癌變的關(guān)系程度未見(jiàn)報(bào)道。本研究Western blot結(jié)果顯示，B組、C組和D組大鼠胃黏膜組織Syk蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而Survivin蛋白表達(dá)則逐漸遞增(P<0.05)；此外，D組大鼠在胃癌進(jìn)展期Syk和Survivin蛋白表達(dá)與B組比較有顯著性差異(P<0.05)。這表明隨著胃癌的進(jìn)展，抑癌Syk蛋白減少，腫瘤細(xì)胞惡性增生、癌變加速；同時(shí)預(yù)測(cè)腫瘤的標(biāo)志物Survivin蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞異常增生。Q-PCR提示C組和D組大鼠胃黏膜組織P53 mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)(P<0.05)，而AMP-18 mRNA水平則逐漸下調(diào)(P<0.05)，且D組大鼠進(jìn)入胃癌進(jìn)展后，胃黏膜組織P53和AMP-18 mRNA水平與B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。這一結(jié)果證實(shí)，胃癌病變進(jìn)展過(guò)程中，P53基因失調(diào)增加了細(xì)胞增生，而AMP-18 mRNA水平在胃癌早期逐漸下降，胃癌進(jìn)展期下降更顯著提示胃黏膜遭到破壞。

綜上所述，本研究比較了不同時(shí)期的胃癌病變中Syk、Survivin、P53及AMP-18等物質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Syk 蛋白、AMP-18 mRNA表達(dá)隨著胃癌病變程度的進(jìn)展明顯下降，而Survivin蛋白、P53mRNA表達(dá)則顯著上升，表達(dá)量與 癌細(xì)胞浸潤(rùn)層次及病變程度有關(guān)。