王 敏，曾代文，，溫珠明

(1.電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都 610054；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是一類常見的消化道疾病，具有病程長，復(fù)發(fā)率高的特點，不僅影響患者生活質(zhì)量也加大患者的醫(yī)療支出。中醫(yī)理論中，肝郁脾虛是此類疾病主要病機之一。Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of cajal，ICCs)是胃腸道運動的起搏、調(diào)節(jié)細胞[1]。干細胞生長因子受體(c-kit)為ICCs特異性表達蛋白，c-kit表達受損會導致平滑肌收縮障礙，影響胃腸道運動[2]。本疏肝和胃方為曾代文醫(yī)師由中醫(yī)經(jīng)典方《六君子湯》、《左金丸方》加減得來，主以健脾祛濕，佐以疏肝和胃之法，在數(shù)十年臨床治療肝郁脾虛性功能性消化不良中取得了較好療效。莫沙必利為臨床治療功能性消化不良的常用藥，主要通過促進胃腸動力改善相關(guān)癥狀。本研究以多因素復(fù)合夾尾法模擬中醫(yī)病機制造肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠模型[3]，對比莫沙必利，研究疏肝和胃方對于肝郁脾虛證FD大鼠胃腸動力、ICCs凋亡、c-kit表達的影響，揭示疏肝和胃方可能的作用機制，為后續(xù)藥物開發(fā)及臨床使用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體重(216.9±13.7)g，均采購于成都達碩實驗動物有限公司。大鼠恒溫飼養(yǎng)，溫度(22±2) ℃，空氣濕度40%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，40只大鼠采用隨機數(shù)字表分四組，即對照組、模型組、莫沙組、疏肝組各10只。

1.2 主要藥物①疏肝和胃藥液：南沙參、白術(shù)(生)、茯苓、陳皮、半夏、黃連、吳茱萸(清炒)、甘草，均由四川省人民醫(yī)院藥學部庫房采購(四川中藥飲片有限責任公司)。稱取上述藥材，第一次加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮1 h，濾過，收集濾液；再分別加以8倍量、6倍量水進行第二次、第三次煎煮，時間均為0.5 h，濾過，收集濾液。合并三次濾液，濃縮、醇沉、回收乙醇、定容，制成濃度為0.95 g/ml的藥液。②莫沙必利混懸液：精密稱取適量枸櫞酸莫沙比利分散片(成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字： H20031116，批號：180418)，以蒸餾水制成濃度為0.15 mg/ml的混懸液。③半固體營養(yǎng)糊：奶粉8 g、CMC-Na 5 g、淀粉4 g、糖4 g、活性炭3 g依次攪拌加入150 ml蒸餾水中，混合均勻，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器Tunel試劑盒(Roche，11684817910)，C-kit 抗體(Thermo，PA5-16770)，CY3山羊抗兔抗體(GB21303)，DAPI(Servicebio，G1012)，抗熒光淬滅封片劑(Servicebio，G1401)，PBS緩沖液(Servicebio)，破膜液(Servicebio)，蛋白酶K(Servicebio)，BSA(Servicebio)；移液槍，組化筆，正置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE C1)、成像系統(tǒng)(NIKON DS-U3)。

1.4 方法2019年4～6月，對照組常規(guī)喂養(yǎng)，其余3組采用疲勞+飲食不規(guī)律+夾尾刺激法進行造模，為期14 d。造模14 d，大鼠體重下降、毛色枯黃、大便稀溏、易受刺激即提示造模成功。實驗3～4 w為給藥期。對照組、模型組、莫沙組、疏肝組每日分別以蒸餾水、蒸餾水、莫沙必利混懸液、疏肝和胃藥液灌胃給藥進行治療，灌胃體積1 ml/100 g，每日稱重。

1.5 觀察指標

1.5.1基本情況 觀察并記錄各組大鼠日常行為學情況、排便情況以及體重變化。

1.5.2胃腸動力 測定給藥期結(jié)束后，實驗大鼠均禁食但不禁水1 d。實驗第29 d，每只大鼠灌胃2 ml半固體營養(yǎng)糊，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。麻醉后迅速解剖，分離胃、小腸，進行稱重、測量，計算胃排空率、小腸推進率：胃排空率=[(胃全重-胃凈重)/灌胃量]×100%。小腸推進率=碳墨在小腸推進的距離/小腸總長度×100%。

1.5.3C-KIT、TUNEL免疫熒光雙染 胃稱重完成后，剪取大小約為0.5 cm3胃竇組織，生理鹽水清洗，石蠟切片脫蠟至水，組化筆圈選組織后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌15 min；切片加入破膜液，常溫孵育20 min，PBS洗滌；加入適量TdT、dUTP混合液(1∶9)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌，3%BSA室溫孵育30 min；加入c-kit抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，CY3山羊抗兔抗體(1∶300)室溫避光孵育50 min；PBS洗滌，DAPI室溫避光孵育10 min，PBS洗滌，抗熒光猝滅封片劑進行封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并進行全片掃描采集圖像。

采用Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA)對切片ICCs凋亡率、 c-kit 平均光密度值(aevarage optical density，AO)進行分析：凋亡率(%)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%；AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差。組間數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時采用方差分析，非正態(tài)分布則采用Kruskal-wallisH檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況所有大鼠初始狀態(tài)良好，毛色光潔，行動自如。造模期間，對照組大鼠飼料消耗逐增、排便正常、毛色光潔、活動自如，體重逐漸增加；造模初始，造模大鼠掙扎尖叫，暴躁，出現(xiàn)打架情況，后期反抗減弱，毛色逐漸枯黃，便溏次數(shù)增多，體重逐漸下降；造模結(jié)束，造模大鼠多倦怠，蜷于籠內(nèi)一角，毛色枯黃，多便溏，體重減輕。治療期間，莫沙組、疏肝組大鼠毛色逐漸恢復(fù)，飼料消耗逐漸增加；治療結(jié)束后，莫沙組、疏肝組大鼠活動自如活躍，便溏減輕，毛色多柔順光潔。體重造模2 w后，相較于對照組，模型組、莫沙組、疏肝組體重均有顯著下降(P均<0.01)，提示造模成功。實驗4 w后，模型組體重仍顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，莫沙組、疏肝組與對照組相比，體重差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實驗期間體重變化 (g)

2.2 各組胃腸動力的比較與對照組相比，模型組胃排空率較低(P<0.01)；莫沙組、疏肝組與對照組胃排空率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；莫沙組、疏肝組胃排空率均顯著高于模型組(P<0.01)。模型組小腸推進率明顯低于對照組、莫沙組、疏肝組(均P<0.01)；莫沙組、疏肝組小腸推進率與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率及小腸推進率比較 (%)

2.3 胃竇組織ICCs凋亡、c-kit表達情況胃竇組織中，ICCs(紅色標記)多分布于環(huán)形肌層、肌間叢、黏膜下層等部位，細胞多處突起，互相連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列緊密(圖1a)。凋亡細胞多成聚集或散在分布于肌層邊緣及黏膜下層等部位(圖4b)。模型組c-kit陽性表達相較于對照組出現(xiàn)明顯下降。疏肝組、對照組c-kit表達較模型組有明顯增強，但疏肝組、莫沙組c-kit表達仍低于對照組，對照組、莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率均顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。莫沙組、疏肝組ICCs凋亡率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胃竇組織ICCs凋亡率及c-kit AO值 (%)

圖1 各組大鼠胃竇組織TUNEL、c-kit雙重免疫組化圖(×400) a:ICCs分布及c-kit表達圖；b:ICCs凋亡圖。紅色為c-kit陽性表達的ICC細胞，綠色為凋亡細胞，黃色為凋亡的c-kit陽性ICC細胞

3 討論

在中醫(yī)理論中，功能性消化不良屬于“胃脘病”的范疇，它多發(fā)于胃，同時還與肝脾關(guān)系密切。《景岳全書·脾胃》說到，“胃司受納，脾主運化，一運一納，化生精氣”，脾胃良好的氣機升降對于食物納受消化具有重要作用，若脾胃氣機升降失調(diào)則對食物消化能力產(chǎn)生影響，從而導致“痞滿”等癥狀的發(fā)生。肝主疏瀉，肝氣條達，則全身氣機暢通，能夠協(xié)助脾胃升降，從而促進脾胃的運化。肝郁氣機升降不暢，脾虛水谷運化失調(diào)，則出現(xiàn)“噯氣”、“痞滿”、“胃脘痛”等病征[4]。運用疏肝和胃法，對功能性消化不良取得了較好的療效[5，6]。

目前對于FD的發(fā)病機制尚不完全明確，眾多臨床及動物實驗研究表明其與胃腸功能障礙、內(nèi)臟高敏感、胃酸分泌異常、幽門螺旋菌感染、腦腸肽及精神心理因素等存在相關(guān)性[7，8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，造模后的大鼠，胃排空明顯延遲、小腸推進率減弱明顯，出現(xiàn)嚴重胃腸動力障礙。上述癥狀在約70%的FD患者中以不同程度存在[9]。產(chǎn)生胃腸動力障礙普遍認為有兩方面原因，一方面為神經(jīng)遞質(zhì)和胃腸激素所誘導的平滑肌收縮舒張異常，另一方面則是胃腸道肌電活動異常。作為胃腸道運動的起搏以及調(diào)節(jié)細胞，ICCs能與胃腸道神經(jīng)、平滑肌細胞形成神經(jīng)纖維ICCs平滑肌細胞 (ENS-ICCs-SMC) 網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生胃腸道運動起步的慢波電位，同時介導神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，形成腸道動力功能的基本單位[10，11]。ICCs能特異性表達c-kit，失去c-kit表達的間質(zhì)細胞不能誘導產(chǎn)生平滑肌收縮運動[12]，此外，作為酪氨酸激酶受體(kit)家族一員，c-kit能夠編碼kit，進而參與ICCs增殖分化，調(diào)控ICCs表型表達及變化[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，在胃食管反流病發(fā)生時，相關(guān)區(qū)域的ICCs陽性面積及染色強度均出現(xiàn)下降[14]，且下降強度與胃食管反流病嚴重程度相關(guān)[15]；糖尿病胃輕癱的發(fā)生會導致胃內(nèi)ICCs超微結(jié)構(gòu)受損，形態(tài)結(jié)構(gòu)的受損、數(shù)量的減少，從而進一步加重胃腸動力障礙。研究人員發(fā)現(xiàn)，刺激骶尾神經(jīng)后的大鼠c-kit表達提高，腸道運輸加快進而提高了結(jié)腸運動功能[16]；進行結(jié)腸吻合術(shù)后的大鼠，c-kit表達下降、小腸蠕動減慢，通過針灸，c-kit表達增加，促進了ICCs和腸道運動功能恢復(fù)[17]。

在FD的中醫(yī)藥基礎(chǔ)以及臨床現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯對于腸道功能具有雙相調(diào)節(jié)作用，能夠增加FD大鼠ICCs數(shù)量[18]，修復(fù)受損ICCs超微結(jié)構(gòu)[19]；健脾疏肝和胃方可通過上調(diào)ICCs表達，提高胃排空率對FD進行治療[20]，疏肝理氣法可能通過下調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caapase9，上調(diào)Bcl-2、PI3K、PDK1、Akt等蛋白表達對PI3K/PDK1/Akt信號通路進行調(diào)控，從而減少由陽明腑實證引起的胃ICCs凋亡[21]；養(yǎng)陰潤腸湯能夠通過恢復(fù)SCF/c-kit通路，進而提高慢傳輸性便秘大鼠的ICC數(shù)量和表達，改善相應(yīng)癥狀[22]；運用電針治療，能顯著增加肝郁脾虛FD大鼠胃電波節(jié)律和胃竇組織ICC表達[23]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ICCs凋亡明顯、c-kit表達減弱，出現(xiàn)明顯的胃腸動力障礙，疏肝和胃方能顯著緩解模型大鼠ICCs凋亡、在一定程度上恢復(fù)c-kit表達，改善模型大鼠胃腸動力。對于模型大鼠出現(xiàn)的情志不條、行為倦怠等基本情況也有一定改善?？赡艿靡嬗诒痉姜毺氐氖韪魏臀钢?，“肝主情志”、“胃不和則臥不安”，肝氣條達脾胃調(diào)和則情志舒緩。

綜上所述，本疏肝和胃方對于肝郁脾虛證功能性消化不良大鼠出現(xiàn)的胃腸動力障礙有一定治療作用，可能的機制為在一定程度上上調(diào)c-kit表達、促進凋亡ICCs的恢復(fù)。本研究實驗結(jié)果顯示，造模后的大鼠ICCs凋亡嚴重，c-kit表達發(fā)生明顯下降，進而出現(xiàn)相應(yīng)的胃腸動力障礙。