趙 燕，陳紅菊，孔維祎，季相山，王 慧

( 1.山東農(nóng)業(yè)大學，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271018； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(煙臺)海洋學院，山東 煙臺 264000 )

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，俗稱青蝦、河蝦，在我國南北方均有分布，是我國重要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類[1]。近幾十年來，日本沼蝦養(yǎng)殖特別是中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)與日本沼蝦的混養(yǎng)發(fā)展迅速，日本沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量及產(chǎn)值越來越高[2]。但與海水蝦類相比，關(guān)于日本沼蝦種質(zhì)資源評價、良種選育等研究的較少[3]。近年來，微衛(wèi)星(SSR)標記憑借其多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性強等優(yōu)點，受到遺傳學研究者的重視，正被迅速用于遺傳連鎖圖譜的建立、種質(zhì)評價、親子鑒定等研究[4-6]。但分離、鑒定微衛(wèi)星標記往往耗費較大的人力物力[7]。表達序列標簽(EST)是通過大規(guī)模cDNA隨機測序產(chǎn)生的，它是開發(fā)遺傳標記SSR的潛在資源，隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，利用高通量測序獲得的表達序列標簽數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR標記經(jīng)濟、高效，而且EST-SSR標記直接位于基因內(nèi)部或基因上下游兩端，利用EST-SSR標記更容易找到與經(jīng)濟性狀相關(guān)聯(lián)的標記[8]。并且，基于全自動DNA遺傳分析儀的SSR熒光標記檢測技術(shù)，用FAM、Hex、VIC和NED等熒光染料標記引物，利用ABI3730X Genetic Analyzer進行毛細管電泳，能精確分析擴增產(chǎn)物的片段長度，比傳統(tǒng)方法更有優(yōu)勢。

國內(nèi)外對日本沼蝦群體遺傳多樣性的研究，通常采用線粒體16S rRNA序列片段變異[9]、線粒體COⅠ序列[10-11]、RAPD[12-13]、AFLP[14]等方法。隨著日本沼蝦SSR標記的大量開發(fā)[3,15-17]，近幾年利用SSR標記分析日本沼蝦群體遺傳多樣性或遺傳結(jié)構(gòu)的研究逐漸增多[18-23]，但大多是對某一水域的日本沼蝦遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，尚未見南、北方不同水域日本沼蝦遺傳結(jié)構(gòu)的比較研究。

筆者首先篩選12個多態(tài)性的EST-SSR標記，接著選取了南、北方較具代表性的4個日本沼蝦地理群體：太湖群體、長江下游群體、微山湖群體和東平湖群體，利用本實驗室已開發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星標記進行熒光SSR分析，比較南、北方日本沼蝦群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的差異，旨在為日本沼蝦種質(zhì)資源評價及良種選育工作等提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA抽提

用于多態(tài)性EST-SSR標記篩選的22尾日本沼蝦取自東平湖的野生群體。用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的日本沼蝦分別為采自無錫淡水漁業(yè)研究中心附近太湖水域的太湖群體，采自東平湖的東平湖群體，采自微山湖的微山湖群體，采自崇明島附近長江下游水域的長江下游群體，每個群體各采集22尾(表1)。基因組DNA抽提采用苯酚—氯仿法。

表1 各群體日本沼蝦采樣量與采樣點

1.2 多態(tài)性EST-SSR標記篩選

基于前期研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(美國國立生物技術(shù)信息中心登錄號：SRX1364905)[17]，依據(jù)3個標準(微衛(wèi)星序列兩端的側(cè)翼序列長度大于100 bp、兩堿基重復(fù)數(shù)大于9、三堿基重復(fù)數(shù)大于7)對測序結(jié)果進一步查找，將符合條件的片段，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，并送上海生工合成。合成好的引物以取自東平湖的22尾日本沼蝦為樣本進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s，各引物退火溫度下退火30 s，72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并將具有多態(tài)性的SSR標記序列提交到美國國立生物技術(shù)信息中心。

1.3 熒光標記SSR

從已經(jīng)開發(fā)的日本沼蝦多態(tài)性微衛(wèi)星引物中挑選8對多態(tài)性水平較高的(A28、A73、D7、B93、B13、B44、B29、Z337)設(shè)計熒光微衛(wèi)星引物(表2)，交由華大基因合成。利用提取的4個群體各22尾日本沼蝦的基因組DNA為模板和合成的熒光引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL，包括：1×PCR buffer，1.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTP，200 μmol/L上下游引物，0.25 U Taq酶，100 ng模板，滅菌去離子水補齊。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s，各引物退火溫度下退火30 s，72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送北京華大基因，用ABI3730X Genetic Analyzer進行毛細管電泳和基因型分型。

表2 熒光SSR引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用POPGENE Version 1.31進行群體遺傳分析，計算微衛(wèi)星等位基因數(shù)、等位基因頻率、各群體間的遺傳距離、觀測雜合度、期望雜合度及哈代—溫伯格平衡檢驗的概率值[24]。利用PIC_CALC 0.6計算多態(tài)信息含量[25]。用MICRO-CHECKER Version 2.2.3軟件分析各位點的無效等位基因頻率[26]。各位點間的多重比較經(jīng)過Bonferroni校正[27]。利用MEGA 6.0構(gòu)建UPGMA進化樹、進行Bootstrap檢驗。利用ARLEQUIN 3.1計算群體內(nèi)固定系數(shù)及群體間分化指數(shù)，并進行分子方差分析[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性EST-SSR標記篩選

日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組測序共得到153 673 014 bp的數(shù)據(jù)，其中有8014個序列包含簡單重復(fù)序列；進一步篩選后共選擇出546個cDNA序列，Blast比對后發(fā)現(xiàn)與已開發(fā)的微衛(wèi)星標記沒有重復(fù)，從中設(shè)計了60對引物，并將其在22尾東平湖日本沼蝦個體中進行了PCR擴增及電泳檢測。結(jié)果顯示，60對引物中有33對能擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，其中12對呈現(xiàn)出良好的多態(tài)性(表3)。這12個多態(tài)性微衛(wèi)星標記的等位基因數(shù)3～7，觀測雜合度0.1724～0.9630，期望雜合度0.1942～0.8462(表4)，BONFERRONI校正之后(校正的P=0.05)有8個偏離哈代—溫伯格平衡。12個多態(tài)性微衛(wèi)星標記中10個多態(tài)性較高(多態(tài)信息含量>0.4)。這些多態(tài)性的微衛(wèi)星標記能用于群體遺傳多樣性分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等工作。

表3 日本沼蝦EST-SSR多態(tài)性標記篩選結(jié)果

表4 日本沼蝦EST-SSR多態(tài)性標記等位基因數(shù)及雜合度

2.2 群體的遺傳多樣性

熒光SSR基因分型結(jié)果顯示，長江下游群體的平均等位基因數(shù)最多(13.5000)，其次是微山湖群體(12.2500)，太湖群體最低(11.8750)。微山湖群體的平均期望雜合度和觀測雜合度均最高(0.8403、0.8350)，東平湖的次之(0.8353、0.7854)，長江下游群體的最低(0.7145、0.7909)(表5)。由此可見，北方2個群體(微山湖與東平湖群體)的遺傳多樣性高于南方2個群體(太湖群體與長江下游群體)。

表5 群體的遺傳多樣性

8個微衛(wèi)星標記在4個日本沼蝦群體中共檢測到166個等位基因，各位點等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為5～29和2.10～17.76，平均每個微衛(wèi)星位點有20.75個等位基因，B44的等位基因數(shù)(29個)和有效等位基因數(shù)(17.76)均為最多；各位點的觀測雜合度為0.5862～0.8851，期望雜合度為0.5279～0.9492，顯示8個位點均具有較高的雜合性；除A73位點(0.4589)外，其他位點多態(tài)信息含量均大于0.8(0.8557～0.9409)，具有高度多態(tài)性(表6)。

表6 微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量

2.3 群體的遺傳分化

分子方差分析顯示，4個日本沼蝦群體中89.29%的變異來源于個體內(nèi)，6.52%的變異來源于群體內(nèi)個體間，4.18%的變異來源于群體間(表7)，顯著性檢驗分析顯示，這4個日本沼蝦群體遺傳分化極顯著(P<0.01)。

表7 日本沼蝦群體分子方差分析

4個日本沼蝦群體兩兩間遺傳分化指數(shù)為0.0031～0.0739，其中東平湖群體與長江下游群體、微山湖群體與長江下游群體的0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15，屬中等分化程度；其他群體間的遺傳分化指數(shù)值均低于0.05，分化程度較弱，其中微山湖與東平湖群體分化程度最弱，為0.0031(表8)。

表8 日本沼蝦群體遺傳分化指數(shù)

2.4 群體的遺傳變異分析

利用POPGENE軟件計算分析，結(jié)果顯示，分化引起的偏離值為-0.1159～0.2775，平均值為0.1055；群體內(nèi)固定系數(shù)為-0.1926～0.2383，平均值為0.0626，顯示群體內(nèi)存在一定程度的近交。群體間的遺傳分化指數(shù)為0.0219～0.0982，平均值為0.0457(小于0.05)，說明群體分化時間較短，分化較弱。各位點的基因流均較大，為2.2946～11.1835，平均為5.2172，表明各群體間的基因流較高(表9)。

表9 各位點的F值和基因流

2.5 群體間遺傳距離

根據(jù)等位基因頻率計算了4個日本沼蝦群體的遺傳相似度和Nei氏遺傳距離(DA)，結(jié)果顯示，各群體間遺傳相似度為0.6312～0.9162，遺傳距離為0.0158～0.3844，北方的微山湖和東平湖2個群體的遺傳相似度最大(0.9162)，遺傳距離最小(0.0158)；長江下游群體和微山湖群體的遺傳相似度最小(0.6312)，遺傳距離最大(0.3844)(表10)。

表10 4個日本沼蝦群體間遺傳相似度(對角線上)和Nei氏遺傳距離(對角線下)

基于遺傳距離的UPGMA聚類結(jié)果顯示，東平湖和微山湖群體先聚為一支，再與太湖群體聚為一支，最后與長江下游群體聚類(圖1)，這種聚類關(guān)系與實際的地理分布吻合，也反映了各日本沼蝦群體的生物地理進化關(guān)系。

圖1 基于遺傳距離的UPGMA聚類樹

3 討 論

3.1 EST-SSR的篩選與應(yīng)用

與Ⅱ型微衛(wèi)星標記相比，Ⅰ型的EST-SSR與已知的基因緊密連鎖或就位于基因內(nèi)部。2004年，Serapion等[29]首次在斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)中開發(fā)和鑒定了EST-SSR，隨后表達序列標簽的數(shù)據(jù)應(yīng)用于許多水產(chǎn)動物的EST-SSR開發(fā)，如美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[30]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[31]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[32]、櫛江珧(Atrinapectinata)[33]、脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)[34]等。筆者設(shè)計了60對引物，33對能擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，55%的比例與中華絨螯蟹(51%)[35]和蜘蛛蟹(Majabrachydactyla)(64%)[36]的結(jié)果相似。由于EST-SSR與基因緊密關(guān)聯(lián)或位于基因內(nèi)部，其更易受到選擇壓力的作用而表現(xiàn)出較高的保守性[31]，并且與Ⅱ型微衛(wèi)星標記相比具有更低的多態(tài)性。在泥蚶中[37]，6個Ⅱ型微衛(wèi)星標記，每個位點平均擴增出5.4個等位基因，平均多態(tài)信息含量為0.546，而34個EST-SSR標記中，平均每個位點擴增出3.59個等位基因，平均多態(tài)信息含量為0.4，EST-SSR標記的多態(tài)性明顯低于Ⅱ型微衛(wèi)星標記。在條斑星鰈(Veraspermoseri)[38]中，Ⅱ型微衛(wèi)星標記，平均每個位點擴增出3.1個等位基因，平均觀測雜合度為0.61，而EST-SSR標記，平均每個位點擴增出2.3個等位基因，平均觀測雜合度為0.42。在擬穴青蟹[31]中，Ⅰ型微衛(wèi)星標記的平均等位基因數(shù)、平均觀測雜合度和多態(tài)信息含量分別為5.9、0.67和0.58，顯著低于Ⅱ型微衛(wèi)星標記的(6.8、0.76和0.67)[39]。在試驗中，12個日本沼蝦EST-SSR，平均每個位點擴增出4.41個等位基因數(shù)，平均觀測雜合度為0.6792，顯著低于用Ⅱ型微衛(wèi)星標記分析的結(jié)果(太湖群體觀測雜合度0.7399、東平湖群體觀測雜合度0.7854、微山湖群體觀測雜合度0.8350、長江下游群體觀測雜合度0.7145)。

近年來，EST-SSR標記正逐漸應(yīng)用于經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析和定位等研究，李鷗等[40]利用70個鯉魚(Cyprinuscarpio)EST-SSR對鯉魚全同胞家系92尾個體的基因組DNA進行掃描，采用擬回交策略對符合1∶1分離的標記與鯉魚飼料轉(zhuǎn)化率性狀進行單標記回歸分析，發(fā)現(xiàn)6個標記與飼料轉(zhuǎn)化率性狀相關(guān)，其中2個達到極顯著水平。Li等[41]研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)GH基因3′UTR區(qū)有2個SSR，其中有些單倍型與黃顙魚體寬、頭長等有顯著的正相關(guān)。胡吟勝等[42]用5對EST-SSR引物對18個瓊枝(Betaphycusgelatinae)個體的基因組進行擴增，結(jié)果顯示，野生群體和養(yǎng)殖群體的多態(tài)性比例分別為74.29%和70.00%；野生群體之間的平均遺傳距離為0.46，養(yǎng)殖群體之間的平均遺傳距離為0.22。綜上，本試驗首次開發(fā)了12個多態(tài)性的日本沼蝦EST-SSR標記，這些標記可應(yīng)用于日本沼蝦遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析等研究。

3.2 日本沼蝦4個地理群體的遺傳多樣性

本試驗使用的8對微衛(wèi)星引物，除A73位點(多態(tài)信息含量為0.4589)屬于中度多態(tài)性位點外，其他位點的多態(tài)信息含量(0.8557～0.9409)均大于0.5，屬于高度多態(tài)性位點[25]，能滿足分析日本沼蝦各群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的需要。本試驗結(jié)果顯示，4個日本沼蝦群體的遺傳多樣性均處于較高水平，尤其是北方的2個群體，微山湖群體的平均期望雜合度和觀測雜合度均最高(0.8403、0.8350)，東平湖次之(0.8353、0.7854)，長江下游群體的最低(0.7909、0.7145)。馮建彬等[18]分析了洪澤湖9個日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性，平均期望雜合度為0.6982～0.8044，平均觀測雜合度為0.3042～0.4604；張敏瑩等[19]的研究結(jié)果表明，洮湖日本沼蝦群體的平均期望雜合度為0.7766，平均觀測雜合度為0.7425；馮建彬等[20]對太湖的吳江、濱湖、宜興和吳興4個日本沼蝦群體的遺傳多樣性分析顯示，4個群體平均期望雜合度為0.8886～0.9149，平均觀測雜合度為0.7500～0.8222。本試驗結(jié)果高于江蘇洪澤湖[18]、洮湖[19]等群體，但略低于太湖群體[20]，說明太湖日本沼蝦群體具有較高遺傳多樣性，其中宜興和濱湖群體遺傳多樣性高于吳江群體。這可能與取樣地點、分析方法及選用的微衛(wèi)星標記多態(tài)性差異有關(guān)?？傮w來說，北方日本沼蝦群體的遺傳多樣性處于較高的水平，可以進行深入的良種選育等工作。

3.3 日本沼蝦4個地理群體的遺傳距離

Wright等[43]認為，0<遺傳分化指數(shù)<0.05，表示分化程度較弱，0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15，表示分化程度中等，0.15<遺傳分化指數(shù)<0.25，表示分化程度較大。本試驗中4個日本沼蝦群體間遺傳分化指數(shù)為0.0031～0.0739，其中東平湖與長江下游群體、微山湖與長江下游群體的遺傳分化指數(shù)介于0.05～0.15，屬中等分化程度；其他群體間的遺傳分化指數(shù)均小于0.05，分化程度較弱，這與馬克異等[1,20-22]的研究結(jié)果相似，說明日本沼蝦群體分化程度不強，但地理比較遠的群體間遺傳分化還是較大，如東平湖群體與長江下游群體(崇明島附近)間、微山湖群體與長江下游群體(崇明島附近)間。通過遺傳分析檢測到具有中等分化程度的群體可以作為選擇育種的基礎(chǔ)群，也可以進行群體間的雜交育種。

基因流指一個種群的基因轉(zhuǎn)移至另外一個種群，它通常是個體遷移的結(jié)果，代表基因之間的交流程度。本試驗結(jié)果顯示，各座位的基因流，介于2.2946～11.1835，平均5.2172，根據(jù)Govindajaru[44]確定的標準，當基因流>1,表明各個群體在各位點間存在著一定的基因流動。

遺傳距離可表示物種間或群體間的基因組差異水平。本試驗中4個日本沼蝦群體的遺傳距離，微山湖和東平湖群體的遺傳距離最小，為0.0158；長江下游群體與東平湖、微山湖群體的遺傳距離較大，分別為0.3449、0.3844，而與太湖群體遺傳距離較小，為0.1836。這與各群體間群體遺傳分化指數(shù)相一致，微山湖與東平湖群體分化程度最弱，為0.0031，長江下游群體與東平湖、微山湖群體屬中等分化程度?；谶z傳距離的UPGMA聚類結(jié)果也顯示了這種一致性，地理位置最近的北方2個群體(東平湖和微山湖群體)首先聚類，然后與太湖群體聚為一支，最后與長江下游群體聚類，這與實際的地理間隔相符，隨著地理距離的增大，親緣關(guān)系漸遠，反映出一定的生物地理進化關(guān)系。