王澤祥，孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

隨著人口的增長(zhǎng)和城鎮(zhèn)化、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的迅速發(fā)展，環(huán)境污染日益加劇，其中農(nóng)產(chǎn)品的污染也逐漸增多，特別是動(dòng)物性食品中的重金屬污染現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重[1]。鎘（Cd）是生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一，鎘化合物經(jīng)人體消化道吸收后不易排出或者分解，會(huì)在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存留，對(duì)人體造成不同程度的危害，尤其對(duì)肝臟和腎臟造成嚴(yán)重的傷害[2,3]。哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期攝入鎘會(huì)導(dǎo)致排卵數(shù)目減少、卵細(xì)胞的受精能力和存活率降低、生育能力下降甚至不孕不育。此外，孕、產(chǎn)婦體內(nèi)富集的鎘化合物可通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒的組織器官，亦可通過(guò)乳汁排出傳播給嬰兒，對(duì)胎兒和嬰兒造成不同程度的損傷，如突變、致癌、致畸等[4-7]。鑒于動(dòng)物性食品中的鎘元素給人類健康所帶來(lái)的巨大危害，建立高效、快速的重金屬鎘離子檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障食品安全和人類健康具有十分重要的意義。

近年來(lái)，動(dòng)物性食品中重金屬的檢測(cè)技術(shù)和方法已得到了較大提升和改進(jìn)，在原子吸收光譜法、原子熒光光譜法和比色法等傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了電感耦合等離子質(zhì)譜法、降級(jí)溶出伏安法等檢測(cè)方法[5,7-9]。然而，這些方法并不能滿足動(dòng)物性食品中重金屬快速檢測(cè)、費(fèi)用低和靈敏度高的要求。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如熒光偏振免疫技術(shù)、免疫膠體金快速層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，是一類新的重金屬離子檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、費(fèi)用低廉、操作方便等優(yōu)勢(shì)[5,9-15]。重金屬離子酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）的原理是通過(guò)將樣品中的重金屬離子與螯合物形成的復(fù)合物與包被在酶標(biāo)板上的金屬-螯合物-蛋白質(zhì)復(fù)合抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，再利用酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得出重金屬離子的含量[12,13]。

本研究運(yùn)用重金屬鰲合劑DTPA和鎘離子制備重金屬鎘完全抗原，免疫新西蘭大耳白兔，制備抗重金屬鎘離子的多克隆抗體，測(cè)定其效價(jià)，并進(jìn)行純化，為建立快速、靈敏、特異的鎘離子ELISA檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DTPA螯合劑、二甲基亞砜（DMSO）和葡聚糖凝膠Sephadex G200均購(gòu)自索萊寶科技有限公司；鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液、HEPES緩沖液、三乙胺、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）、超純水儀（美國(guó)Millipore公司）、磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）、冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Plextech公司）、脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）、超濾離心管（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大耳白兔（2.0 kg左右）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠。

1.4 金屬鎘完全抗原的制備

重金屬鎘離子完全抗原的制備過(guò)程：稱取50mg的DTPA溶于15mlDMSO中，在磁力攪拌器中緩慢溶解20 min，制備成金屬螯合劑溶液；稱取100 g牛血清白蛋白質(zhì)（BSA），溶于HEPES緩沖溶液（10 mmol，pH 7.5）；將溶解的牛血清白蛋白溶液緩慢逐滴加入金屬螯合劑溶液中，然后加入500μL三乙胺溶液，在磁力攪拌器中緩慢攪拌均勻后反應(yīng)24 h；使用100 mmol/L EDTA和0.1 mol/L、pH=7.4 HEPES緩沖液預(yù)處理的超濾管4℃、6 000 rpm離心超濾15 min去除未偶聯(lián)的DTPA；用pH 7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL，反應(yīng)4 h后，4℃、6 000 rpm離心超濾30 min除去未螯合的鎘離子，再用pH 7.4的HEPES緩沖液稀釋截留物，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 金屬鎘完全抗原的鑒定

完全抗原應(yīng)用SDS-PAGE電泳鑒定，取BSA、DTPA-BSA、Cd-DTPA-BSA分別用三蒸水稀釋到適當(dāng)濃度，煮沸10 min，灌制12%濃縮膠和5%分離膠，加入電極緩沖液，每孔上樣量10μL，Marker按說(shuō)明書(shū)處理，設(shè)定電壓為60 V，進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍(lán)指示劑離底線1 cm時(shí)停止，考馬斯亮藍(lán)染色20～30 min，脫色至透明。

1.6 重金屬鎘完全抗原蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定

運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重金屬鎘離子完全抗原中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.7 重金屬鎘多克隆抗體的制備

取5只體重2 kg的雄性新西蘭大耳白兔作為免疫動(dòng)物，同時(shí)抽取免疫前的動(dòng)物血清作為陰性對(duì)照。將制備好的免疫抗原0.5 mg與等體積的完全弗氏佐劑混合制成乳劑，采用皮下多點(diǎn)注射，完成初次免疫。4周之后，取0.5 mg免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑混勻，同法進(jìn)行第二次免疫，此后每2周運(yùn)用0.5 mg免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑免疫1次，于第五次免疫后1周心臟采血，分離血清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體純化純度的測(cè)定

應(yīng)用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體純度，將SDS-PAGE電泳完成后的凝膠置于染色液中染色，之后放于脫色液中脫色，直至凝膠底色脫為無(wú)色，觀察染色條帶。

1.9 重金屬鎘多克隆抗體的純化

取抗體血清運(yùn)用Sephadex G-200凝膠柱層析法純化多克隆抗體。具體步驟：第一，Sephadex G-200凝膠沸水浴5 h，冷卻至室溫后裝柱，保證柱內(nèi)無(wú)氣泡且顆粒均勻。第二，用pH 7.4 PBS緩沖液平衡、洗脫。第三，收集不同峰時(shí)的抗體，裝入透析袋，周圍堆積PEG 6 000濃縮。濃縮后的多克隆抗體運(yùn)用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度。

1.10 重金屬鎘多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

應(yīng)用斑點(diǎn)ELISA法檢測(cè)抗重金屬鎘多克隆抗體的效價(jià)，取硝酸纖維素膜（NC膜）修剪成4 cm見(jiàn)方的方格，應(yīng)用0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液浸泡10 min，室溫放置干燥后，將其用免疫抗原Cd-DTPA-BSA稀釋液1μL包被，室溫靜置1 h；用50 g/L的脫脂乳37℃封閉1 h，然后用PBST洗滌3次，每次5 min；室溫干燥后加入5μL梯度稀釋一抗，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，置于37℃孵育1 h，然后用PBST洗滌3次，每次5 min；加入5μL 1:10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫放置30 min后用PBST洗滌3次，每次5 min；每格加入適量DAB顯色液，避光顯色5～10 min，終止反應(yīng)后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重金屬鎘完全抗原Cd-DTPA-BSA的SDS-PAGE鑒定

通過(guò)蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的遷移率來(lái)判斷各種抗原的相對(duì)分子質(zhì)量的變化。合成的DTPA-BSA和Cd-DTPA-BSA相對(duì)于BSA均存在滯后現(xiàn)象，表明二者分子質(zhì)量均有增加，且Cd-DTPA-BSA相當(dāng)于DTPA-BSA也有滯后現(xiàn)象，表明前者比后者分子質(zhì)量增加更大，這與理論上抗原合成成功現(xiàn)象相符（見(jiàn)圖1）。

2.2 免疫抗原的蛋白質(zhì)濃度

運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度為3.58 mg/ml。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體的純度

依據(jù)蛋白質(zhì)分子Marker標(biāo)記，運(yùn)用凝膠柱層析法對(duì)制備的重金屬鎘多克隆抗體純化后的純度在80%以上（見(jiàn)圖2）。

2.4 斑點(diǎn)ELISA測(cè)定抗重金屬鎘多克隆抗體效價(jià)結(jié)果

經(jīng)觀察，陽(yáng)性反應(yīng)為淡綠色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)顏色隨著抗體滴度的升高而變淺，兔抗重金屬鎘多克隆抗體的效價(jià)為1:1 600。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年向環(huán)境中排放數(shù)萬(wàn)噸的重金屬鎘，其中有很大一部分流向土壤和水源，從而污染飲用水和農(nóng)產(chǎn)品。因環(huán)境中的重金屬降解非常緩慢，重金屬鎘會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入家畜體內(nèi)逐漸蓄積，從而污染動(dòng)物性食品[5,14-16]。因此，快速靈敏的檢測(cè)動(dòng)物性食品中的重金屬鎘殘留是保障食品安全和保護(hù)人類健康的重要措施。重金屬免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為動(dòng)物性食品中重金屬殘留檢測(cè)的主流技術(shù)，該技術(shù)以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)。重金屬離子本身無(wú)免疫原性，需要先與重金屬螯合劑形成復(fù)合物，通過(guò)載體如牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）偶聯(lián)復(fù)合物，從而形成完全抗原作為免疫抗原[9,17-18]。本研究應(yīng)用雙功能螯合劑DTPA、牛血清白蛋白（BSA）與重金屬鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液制備重金屬鎘完全抗原Cd-DTPA-BSA,采用弗氏免疫佐劑免疫新西蘭大耳白兔，大量制備抗重金屬鎘離子兔多克隆抗體，并應(yīng)用凝膠柱層析法對(duì)制備的重金屬鎘多克隆抗體純化。所獲得的兔多克隆抗體效價(jià)較高，抗體純化效果較好，為下一步重金屬鎘離子ELISA試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。