張瀟丹

【摘要】目前5-脂氧酶抑制劑的篩選方法有放免法、HPLC法和比色法等，但因?qū)嶒?yàn)條件、價格或靈敏度等原因并不適合體外高通量初篩。本文基于5-脂氧酶代謝底物中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基可使探針二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯發(fā)生轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光的機(jī)理，建立了一種細(xì)胞水平的5-脂氧酶抑制活性分析的體系，采用陽性藥物咖啡酸來驗(yàn)證方法可靠性。

【關(guān)鍵詞】熒光探針 5-脂氧酶抑制劑? 篩選

5-脂氧酶介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）氧化產(chǎn)生的白三烯與哮喘、關(guān)節(jié)炎、腸道炎癥等許多炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展密不可分。研究發(fā)現(xiàn)，5-脂氧酶代謝AA過程中產(chǎn)生大量氫過氧化物。本文將基于白細(xì)胞內(nèi)5-脂氧酶代謝AA產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基可使DCFH探針氧化生成發(fā)熒光的DCF探針的機(jī)理，建立一種適用于細(xì)胞水平的5-脂氧酶抑制劑體外高通量篩選方法。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器與試劑

奧林巴斯熒光顯微鏡（IX71，日本奧林巴斯株式會社）;多功能酶標(biāo)儀（SynergyTM HT，Bio-Tek）。

三磷酸腺苷（ATP，重慶川東化工有限公司）;花生四烯酸（sigma，USA）;二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA，sigma，USA）;咖啡酸（Caffeic acid，成都普思生物科技有限公司，純度>98%）;以上均用PBS緩沖液配制。HBSS溶液（Hyclone，USA）;人外周血白細(xì)胞（106cells/mL）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.5-脂氧酶活性測試體系的優(yōu)化及建立

如表1，往106cells/mL的白細(xì)胞懸液中加入不同試劑形成對照組、實(shí)驗(yàn)組。其中，熒光探針DCFH-DA終濃度10μmol/L，AA70μmol/L、CaCl22.5mmol/L，ATP2mmol/L。均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，離心洗滌3次，HBSS緩沖液重懸后接種于96孔板。于488nm激發(fā)波長和525nm發(fā)射波長進(jìn)行熒光檢測，測定0min和90min的熒光值。每組6個平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2.陽性對照物咖啡酸測試

采用咖啡酸作陽性對照物，如表2所示，往106cells/mL的白細(xì)胞懸液中加入不同試劑形成實(shí)驗(yàn)組、對照組。熒光檢測，測定0～90min的熒光值變化。每組6個平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

二、結(jié)果與討論

（一）熒光探針法測定5-脂氧酶活性影響因素分析

如圖1所示，缺少DCFH-DA，體系無熒光;缺少細(xì)胞，體系僅僅表現(xiàn)出探針自身的微弱熒光;相比于Complete組，缺少ATP，體系熒光值減弱35%;缺少CaCl2，減弱15%;缺少AA，減弱81%。加入AA與否，體系的熒光強(qiáng)度值差別很大，說明AA的存在對該反應(yīng)體系是必要的，這應(yīng)與該酶反應(yīng)體系具底物特異性的性質(zhì)有關(guān)。而Ca2+與5-脂氧酶的激活密不可分，而ATP更是酶反應(yīng)的能量供應(yīng)者。因此，Ca2+和ATP的存在對該酶反應(yīng)體系有影響，表現(xiàn)為缺少時體系熒光有變化。但該變化表現(xiàn)為減弱15%和35%，或與細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性鈣離子和ATP有關(guān)。

如圖2所示，熒光探針DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入后被白細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成無熒光的DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而實(shí)現(xiàn)熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的裝載。5-脂氧酶催化AA產(chǎn)生二十碳酸類化合物，與白細(xì)胞中內(nèi)源性的ROS（Reactive oxygen species）一樣，其可將不發(fā)熒光的DCFH分解為發(fā)熒光的DCF。在底物AA過量情況下，通過測定熒光變化值可以間接反應(yīng)5-脂氧酶的酶催化效率。在5-脂氧酶高表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，5-脂氧酶信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞內(nèi)源性ROS信號，所以探針表現(xiàn)出5-脂氧酶依賴性。

（二）陽性對照物測試

采用咖啡酸作為陽性對照物測試，熒光儀測得體系熒光值隨時間的變化曲線（圖3），實(shí)驗(yàn)Caffeic acid組的白細(xì)胞平均相對熒光強(qiáng)度-時間曲線要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照Complete組，甚至低于空白ROS組（圖3插圖）。這說明咖啡酸不僅抑制了白細(xì)胞內(nèi)二十碳酸類化合物等脂質(zhì)自由基的產(chǎn)生，還強(qiáng)烈的抑制了細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基。

三、結(jié)論

本文建立了一種適于體外高通量篩選的5-脂氧酶抑制劑篩選體系：熒光探針DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，可被酯酶水解生成無熒光的DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而實(shí)現(xiàn)熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的裝載。利用5-脂氧酶催化AA產(chǎn)生的二十碳酸類化合物可將無熒光的DCFH分解為發(fā)熒光的DCF的能力，通過外加酶反應(yīng)底物及反應(yīng)所需的ATP和Ca2+等，放大細(xì)胞內(nèi)的酶反應(yīng)過程，排除細(xì)胞內(nèi)源性ROS的影響，從而實(shí)現(xiàn)藥物對5-脂氧酶活性影響的檢測。采用咖啡酸作陽性對照物進(jìn)行了可靠性測試，信號明顯，有望在5-脂氧酶抑制劑篩選上發(fā)揮價值。

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