劉 萌，邢 輝，張玉琪，李 巖，王瑩瑩，安 寧，路新利

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active anti-retrovirus therapy, HARRT)可以有效抑制HIV病毒的復(fù)制，從而降低HIV感染者/艾滋病患者體內(nèi)病毒載量，使機(jī)體免疫能力得到恢復(fù)或部分恢復(fù)，因此HARRT可以作為預(yù)防HIV病毒傳播的有效手段[1]，但隨著發(fā)現(xiàn)即治政策的實(shí)施，HARRT范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，HIV-1耐藥基因突變已成為治療效果下降的主要原因[2]。因此加強(qiáng)對(duì)抗病毒治療前人群的HIV-1耐藥監(jiān)測(cè)，可以為阻斷HIV-1耐藥株的傳播提供早期預(yù)警，并對(duì)監(jiān)控HIV-1耐藥毒株傳播規(guī)律具有重要社會(huì)意義。本研究對(duì)河北省2018年上半年抗病毒治療前人群開(kāi)展了HIV-1耐藥毒株流行情況橫斷面調(diào)查，為本省預(yù)防HIV-1耐藥毒株傳播及建立有效耐藥預(yù)警機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 河北省轄區(qū)內(nèi)2018年1月至6月新診斷報(bào)告的HIV-1感染者。入組標(biāo)準(zhǔn)為：年齡≥18歲、均未參加抗病毒治療、本省籍、已提供知情同意書(shū)。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集 使用EDTA抗凝采血管采集研究對(duì)象的外周靜脈血10 mL，24 h內(nèi)離心分離血漿，-70 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，收集包括人口學(xué)信息、感染途徑等流行病學(xué)信息。

1.2.2目的基因片段擴(kuò)增 采用QIAsymphony SP全自動(dòng)核酸提取儀提取血漿HIV-1 RNA，通過(guò)In-house法擴(kuò)增HIV-1pol區(qū)基因(1.3 kb)，對(duì)應(yīng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)參考株HXB2的位置為2253-3553b。第一輪RT-PCR外引物擴(kuò)增以RNA為模板，使用F1a(5′-TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT-3′, HXB2:2057-2085)和RT-R1(5′- ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC-3′， HXB2:3370-3348)引物，按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit說(shuō)明書(shū)要求配置反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件。第二輪PCR擴(kuò)增以外引物擴(kuò)增產(chǎn)物的1∶10稀釋液作為模板，以F2(5′-CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT-3′, HXB2:2243-2266)和R2(5′-CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC-3′, HXB2: 3326-3304)為引物，按照TaKaRaTaq說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析 用Sequencher4.10.1軟件對(duì)原始反應(yīng)序列進(jìn)行校對(duì)和拼接，用BioEdit7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和整理。使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建N-J (Neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(bootstrap設(shè)定為1000，校驗(yàn)值≥70%判定為同一亞型)；將目的基因序列提交斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hivdb.stanford.edu)，根據(jù)2014版WHO耐藥監(jiān)測(cè)方案[3]，選擇耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)全部20種耐藥藥物進(jìn)行耐藥基因型分析及耐藥水平判定；將比對(duì)好的序列導(dǎo)入Hyphy2.2.4，利用TN93模型計(jì)算所有序列兩兩之間的基因距離，通過(guò)觀測(cè)不同閾值下傳播網(wǎng)絡(luò)中的傳播簇總數(shù)和連接總數(shù)的變化來(lái)確定最適基因距離閾值，序列間基因距離小于閾值表示他們感染密切相關(guān)，在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)會(huì)連接在一起，利用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SAS 9.2軟件進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，探討HIV-1耐藥相關(guān)影響因素。

2 結(jié) 果

2.1流行病學(xué)特征 在獲得目的基因序列的276例HIV-1感染者中，以18～49歲(84.4%，233/276)、男性(94.2%，260/276)、已婚(47.8%，132/276)、漢族(97.1%，268/276)、初高中及中專文化學(xué)歷(63.0%，174/276)，同性性傳播途徑(75.0%，207/276)為主；CRF01_AE是最主要基因型，占49.6%(137/276)，其次是CRF07_BC(29.7%，82/276)、B(9.8%，27/276)、URFs(4.3%，12/276)、CRF55_01B(2.9%，8/276)、CRF08_BC(1.1%，3/276)、CRF68_01B(1.1%，3/276)、CRF65_cpx(1.1%，3/276)和CRF80_0107(0.4%，1/276)。URFs重組模式包括URF_01B(2.9%，8/276)、URF_01C(0.3%，1/276)、未知(1.1%，3/276)。

2.2耐藥位點(diǎn)及耐藥程度分析 HIV-1耐藥率為6.16%(17/276)。其中，NRTI類耐藥率為0.36%(1/276)，出現(xiàn)耐藥的位點(diǎn)為L(zhǎng)74I，對(duì)阿巴卡韋(ABC)中度耐藥、去羥基苷(DDI)高度耐藥；NNRTI類耐藥率為4.35%(12/276)，其中有5例攜帶耐藥位點(diǎn)K103R/V179D，導(dǎo)致依非韋倫(EFV)、奈韋拉平(NVP)中度耐藥，利匹韋林(RPV)低度耐藥；有2例研究對(duì)象對(duì)EFV、NVP產(chǎn)生高度耐藥；PI類耐藥率為1.09%(3/276)，耐藥突變?yōu)镸16I/L，對(duì)奈非那韋(NFV)產(chǎn)生耐藥；NNRTI及PI類藥物的雙重耐藥率為0.36%(1/276)；HIV-1耐藥突變位點(diǎn)及其耐藥程度詳見(jiàn)表1。

表1 抗病毒治療前HIV-1耐藥突變分析Tab.1 HIV-1 drug resistance mutations before antiviral therapy

2.3耐藥影響因素分析 針對(duì)性別、民族、婚姻、感染途徑、年齡、文化程度、亞型6個(gè)變量進(jìn)行耐藥多因素Logistic回歸分析(見(jiàn)表2)。 結(jié)果顯示年齡(P<0.05)和亞型(P<0.05)是HIV-1發(fā)生耐藥突變的顯著性影響因素。18～29歲處于性活躍期的青年耐藥發(fā)生率最高，達(dá)到8.16%，其次是50歲以上的老年人(6.98%)；作為河北省主要的3種流行毒株，CRF01_AE亞型耐藥率為8.03%(11/137)，CRF07_BC亞型耐藥率為2.44%(2/82)，B亞型耐藥率為3.70%(1/27)。而其他變量對(duì)耐藥突變的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò) 利用TN93模型計(jì)算276條pol基因序列基因距離，在0.5%～2.0%的基因距離間，1.5%基因距離閾值下，傳播簇分辨率高且分子網(wǎng)絡(luò)中能區(qū)別的傳播簇最多，在此閾值下，構(gòu)建HIV-1分子網(wǎng)絡(luò)圖，共有95條序列入網(wǎng)，入網(wǎng)率為34.4%(95/276)，共鑒別出30個(gè)傳播簇，其中≥3個(gè)節(jié)點(diǎn)的傳播簇共有9個(gè)。CRF07_BC序列在網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)成比最高，包括9個(gè)傳播簇，其中1個(gè)傳播簇包含27個(gè)節(jié)點(diǎn)，是網(wǎng)絡(luò)內(nèi)最大的傳播簇，傳播風(fēng)險(xiǎn)較高；CRF01_AE序列在網(wǎng)絡(luò)中共包含16個(gè)傳播簇，其中發(fā)現(xiàn)K103R/V179D耐藥突變毒株在滄州地區(qū)同性性行為人群構(gòu)成的三節(jié)點(diǎn)傳播簇中傳播，造成對(duì)EFV/NVP中度耐藥，RPV低度耐藥；M46I耐藥突變毒株在張家口地區(qū)同性性行為人群構(gòu)成的兩節(jié)點(diǎn)傳播簇中傳播； URF_01B序列在網(wǎng)絡(luò)中包括2個(gè)傳播簇(7例)，該傳播簇?cái)y帶V106I潛在耐藥突變，在保定、滄州地區(qū)同性及異性性行為人群構(gòu)成的五節(jié)點(diǎn)傳播簇中傳播，在石家莊地區(qū)同性性行為人群構(gòu)成的二節(jié)點(diǎn)傳播簇中傳播；B亞型序列在網(wǎng)絡(luò)中形成1個(gè)三節(jié)點(diǎn)傳播簇，同樣攜帶V106I潛在耐藥突變位點(diǎn)。詳見(jiàn)圖1與表3。

圖1 抗病毒治療前HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 HIV-1 molecular transmission network before antiviral therapy

2.5URF_01B重組亞型鑒定 利用鄰接法構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，共檢出8例(2.90%) URF_01B重組亞型。8例URF_01B與石家莊地區(qū)2015年、2018年報(bào)道[6-7]的CRF01_AE/B重組亞型獨(dú)立聚集成簇，校驗(yàn)值為100%，初步判定這8例URFs為CRF01_AE/B重組亞型，通過(guò)HIV Database在線RIP 3.0軟件對(duì)8例URFs的基因序列進(jìn)行鑲嵌結(jié)構(gòu)分析，確定其為CRF01_AE和B亞型重組體。

表2 抗病毒治療前HIV-1耐藥影響因素分析Tab.2 Factors influencing HIV-1 drug resistance before antiviral therapy

表3 抗病毒治療前HIV-1分子網(wǎng)絡(luò)中耐藥株情況Tab.3 Information of HIV-1 resistant strains circulating in the molecular network before antiviral therapy

Black dot(●) denotes HIV-1 URF_01B； Black triangle(▲) denotes reference sequences圖2 8例URF_01B重組毒株pol區(qū)序列Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on HIV-1 pol gene sequences from URF_01B strains

3 討 論

本研究結(jié)果顯示CRF01_AE、CRF07_BC和B亞型是目前河北省前3個(gè)主要HIV-1流行毒株，與河北省鄰近地區(qū)北京和天津市的HIV-1流行毒株流行形式基本一致[4-5]。8例URF_01B與石家莊地區(qū)2015年、2018年報(bào)道[6-7]的CRF01_AE/B重組亞型獨(dú)立聚集成簇，在1.5%基因距離閾值下，7例URF_01B序列入網(wǎng)，這7例感染者分布在河北省中部及南部地區(qū)的石家莊、保定、滄州的同性傳播及異性傳播人群中，表明該重組亞型已通過(guò)性傳播方式發(fā)生跨地區(qū)傳播，且傳播關(guān)系相對(duì)較近。而且，7例URF_01B患者均攜帶V106I潛在耐藥突變位點(diǎn)。

同時(shí)證明抗病毒治療前HIV-1耐藥突變發(fā)生率為6.16%，低于北京市[4]、河南省[8]等臨近省市，與全國(guó)耐藥數(shù)據(jù)平均水平基本持平[9]。其中有3例產(chǎn)生高度耐藥，10例產(chǎn)生中度耐藥，4例產(chǎn)生低度耐藥。NNRTI類耐藥率最高為4.35%，主要耐藥突變?yōu)镵103R/V179D，對(duì)依非韋倫(EFV)、奈韋拉平(NVP)中度耐藥，對(duì)利匹韋林(RPV)低度耐藥；NRTI類耐藥率為0.36%，出現(xiàn)耐藥的位點(diǎn)為L(zhǎng)74I，對(duì)阿巴卡韋(ABC)中度耐藥、去羥基苷(DDI)高度耐藥；PI類耐藥率為1.09%，耐藥突變?yōu)镸16I/L，對(duì)奈非那韋(NFV)產(chǎn)生耐藥；NNRTI及PI類藥物的雙重耐藥率為0.36%，尚未發(fā)現(xiàn)三重耐藥HIV-1感染者。

CRF01_AE作為目前河北省最主要流行毒株，其在滄州地區(qū)同性性行為人群中存在K103R/V179D耐藥突變位點(diǎn)的三節(jié)點(diǎn)傳播簇傳播，張家口地區(qū)同性性行為人群中存在M46I耐藥突變位點(diǎn)兩節(jié)點(diǎn)傳播簇傳播，這兩簇傳播簇同樣存在較大的跨地域擴(kuò)散傳播風(fēng)險(xiǎn)。雖然HIV-1耐藥突變?cè)贑RF07_BC(2.44%)亞型中的分布明顯低于CRF01_AE(8.03%)和B(3.70%)亞型，然而CRF07_BC序列構(gòu)建的分子傳播網(wǎng)絡(luò)最多，傳播速度最快。在當(dāng)前性傳播(特別是男男同性傳播)已成為河北省主要傳播途徑的背景下，處在性活躍期的18～29歲青年成為耐藥突變產(chǎn)生的影響因素，會(huì)加速耐藥毒株向外傳播。

綜上所述，河北省抗病毒治療前HIV-1耐藥毒株傳播風(fēng)險(xiǎn)較高，且有新型重組毒株URF_01B攜帶相關(guān)潛在耐藥突變位點(diǎn)成簇傳播。因此，加強(qiáng)HIV-1耐藥毒株分子傳播動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)實(shí)施精準(zhǔn)治療和干預(yù)措施，對(duì)降低耐藥突變對(duì)抗病毒治療效果的影響，防止耐藥毒株傳播具有重要意義。

利益沖突：無(wú)