董倩，葉旭，廖前進，周鈺娟，楊锫，楊敬儒，楊松華，朱笑叢，曾娜，師穎瑞

[1.南華大學 臨床醫(yī)學系，湖南 衡陽 421001；2.湖南省腫瘤醫(yī)院（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院） 放射治療科，湖南 長沙 410013]

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率居惡性腫瘤第6 位，病死率居第4 位[1]，對無法手術(shù)或拒絕手術(shù)的局部晚期食管癌患者，放療是重要的治療手段[2]。然而，因為部分腫瘤對放射線抵抗導致局控率降低，放療后約40%～60%食管癌患者治療未控或者復發(fā)[3]。原發(fā)性及獲得性放療抵抗是影響腫瘤治療效果和患者生存預后的重要因素，因此，尋找可以預測食管鱗狀細胞癌（以下簡稱食管鱗癌）放療敏感性的生物標志物有重要意義。本研究應用免疫組織化學法檢測食管鱗癌組織中Cdc25C 的表達情況，并分析Cdc25C 表達在食管鱗癌預后判斷及臨床療效監(jiān)測中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011月1月—2016年12月湖南省腫瘤醫(yī)院確診的食管鱗癌患者，最終納入50 例進行回顧性研究（實驗組）。其中，男性40 例，女性10 例；年齡32 ～70 歲（中位年齡61 歲）；頸段6 例，胸上段18 例，胸中下段26 例；高分化鱗癌9 例，中分化鱗癌19 例，低分化鱗癌22 例；臨床分期采用2009年美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第7 版食管鱗癌的分期標準[4]，Ⅱ期18 例，Ⅲ期32 例；根據(jù)增強胸部CT 和其他檢查結(jié)果，診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15 例。所有患者行根治性放射治療，放療方式為三維適形放療或調(diào)強放射治療，計劃腫瘤靶區(qū)（PGTV）為60 ～64 Gy/30-33 F。本研究同時選取20 例食管鱗癌旁正常組織作為對照組。

1.2 主要試劑和方法

兔單克隆抗體抗Cdc25C[E302]購自美國Abcam公司，免疫組織化學染色采用SP 法，兔/鼠通用型SP試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司，食管鱗癌組織及食管鱗癌旁正常組織均由湖南省腫瘤醫(yī)院病理科提供。免疫組織化學所有操作步驟均按試劑盒說明書進行，一抗的工作濃度為1 ∶300。用PBS 代替一抗做空白對照。

1.3 免疫組織化學結(jié)果判定

表達結(jié)果按照染色強度和染色范圍綜合計分。染色強度分為4 級： 不顯色為0 分；淺黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。染色范圍（高背景下的陽性細胞所占百分比）分為4 級： 無陽性細胞計為0 分；陽性細胞1%～20%為1 分；＞20%～75%為2 分；＞75%為3 分。兩分級相乘，≤4 分定義為Cdc25C 低表達，＞4 分定義為Cdc25C 高表達。

1.4 評價標準

放療結(jié)束后1 ～3 個月復查食管鋇餐進行近期療效評價。近期療效評價采用萬均教授食管癌放療后療效評價標準[5]。完全緩解（complete response, CR）即腫瘤病灶完全消失，食管邊緣光滑，鋇劑通過順利，管壁可稍顯強直，管腔無明顯狹窄或稍顯狹窄，黏膜基本恢復正常或增厚；部分緩解（partial response,PR）即病變大部分消失，無明顯扭曲或成角畸影，無向腔外潰瘍，鋇劑通過尚順利，且邊緣欠光滑，有小的充盈缺損或/和小龕影，或邊緣雖光滑，但管腔有明顯狹窄；無緩解（no response, NR）即放療結(jié)束時，病變看不出明顯好轉(zhuǎn)，或充盈缺損及龕影或狹窄加重。

1.5 隨訪

所有隨訪信息均來自病例系統(tǒng)及電話隨訪，隨訪內(nèi)容包括食管鋇餐以及總生存期（overall survival,OS）。隨訪時間自治療結(jié)束后1 個月后開始計算，截止到2018年10月31日。OS 是指從疾病確診的日期到死亡日期或者隨訪截止日期的時間，本研究的隨訪終點為OS。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素分析用多因素Cox 風險回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cdc25C 在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達情況

Cdc25C 陽性染色主要定位在細胞核中，呈黃棕色或棕褐色顆粒，背景不著色。對照組Cdc25C 表達水平較低，呈現(xiàn)低表達，實驗組Cdc25C 表達水平上調(diào)。Cdc25C 在實驗組中高表達58%（29/50），在對照組中低表達0%（0/20）。見圖1。

圖1 Cdc25C 在食管鱗癌及癌旁組織中的表達情況 （SP 法×400）

2.2 Cdc25C 表達水平與患者臨床特征的關(guān)系

Cdc25C 表達水平與食管鱗癌患者的性別、年齡、部位、T 分期及分化程度無關(guān)（P＞0.05），但與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高、臨床分期越晚，其在食管鱗癌組織中的表達越強。見表1。

表1 食管鱗癌患者Cdc25C 表達陽性率的比較

2.3 近期療效

Cdc25C 高表達組29 例，其中CR 7 例，PR 20 例，NR 2 例；Cdc25C 低表達組21 例，其中CR 14 例，PR 7 例，NR 0 例。將Cdc25C 表達水平和食管鱗癌患者近期療效采用χ2檢驗進行關(guān)聯(lián)性檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.557，P=0.008），Cdc25C 高表達組近期療效較差。

2.4 生存分析

實驗組1、2 及3年總生存率為82%、56%和24%，中位生存時間是24.5 個月；Cdc25C 高低表達兩組1、2 及3年總生存率分別為72%、45%、10%和90%、67%、48%。Cdc25C 高表達組生存率低于低表達組（χ2=6.846，P=0.009）。見圖2。

圖2 Cdc25C 高表達組與低表達組的生存曲線

2.5 影響食管鱗癌患者預后的因素

對患者性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度、Cdc25C 表達水平進行單因素分析，結(jié)果顯示Cdc25C 高表達、臨床分期與食管鱗癌不良預后相關(guān)（P＜0.05）。將單因素分析有統(tǒng)計學意義的因素納入多因素Cox 風險回歸模型，結(jié)果表明Cdc25C 在食管鱗癌組織中表達水平是食管鱗癌患者預后的獨立因素[=0.399（95% CI： 0.176，0.906），P=0.028]。見表2、3。

表2 食管鱗癌患者單因素預后分析

表3 食管鱗癌患者多因素預后分析參數(shù)

3 討論

食管癌發(fā)病率高，預后差，嚴重威脅人類的生命安全。早期食管癌首選手術(shù)切除已成為共識，并且療效確切，但對局部晚期食管癌單純手術(shù)切除5年生存率仍較低，而大多數(shù)患者就診時已處中晚期[6-7]，同步放化療是非手術(shù)局部晚期食管癌標準治療模式[8]。在我國，鱗癌是食管癌的主要病理類型，約占90%，鱗癌對放療中度敏感，單純放療時5年生存率僅10%～15%[9-10]。然而，食管鱗癌細胞存在放射敏感性差異，增加放射治療的劑量并不一定能改善5年生存率或無病生存[11]，因此，放療之前或者放療期間準確預測食管癌的放療敏感性，采取合理的個體化治療方案，尋找可以預測食管癌放療療效的生物標志物顯得尤為重要。

近年來，與食管癌放療敏感性有關(guān)的分子標志物陸續(xù)報道，目前報道較多的有抑癌基因P53、細胞周期調(diào)控子（Cdc25C、Cyclin D1）、DNA 損傷修復相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子（HDAC1、端粒酶）等[12]，其中Cdc25C 是細胞分裂磷酸化酶25 家族中的一員，參與真核細胞有絲分裂周期的調(diào)控，在正常的細胞周期中具有重要作用，若其表達異常，將會導致細胞周期紊亂、失常，從而發(fā)生腫瘤[13]。已有眾多研究顯示，Cdc25C 是一種腫瘤相關(guān)抗原[14]，在對肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)Cdc25C 的表達較正常組織升高，提示Cdc25C 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[15]。

目前，關(guān)于Cdc25C 影響食管癌細胞放療敏感性機制可能有多種，但具體機制仍不清楚。放療主要是電離輻射通過直接作用或間接作用導致細胞DNA 的損傷，從而引起細胞死亡[16]。放療效果不佳主要有兩方面的原因： ①細胞本身原因或其腫瘤細胞微環(huán)境保護從而導致細胞對射線不敏感；②電離輻射后DNA損傷修復；后者是主要因素[17]。在細胞修復的過程中，細胞周期檢驗點蛋白表達水平的差異在DNA 損傷修復方面具有舉足輕重的作用[18]，腫瘤細胞的高DNA損傷修復能力將導致對放射線的抵抗。有文獻報道，腫瘤細胞受到輻射損傷后產(chǎn)生的DNA 雙鏈斷裂主要通過激活ATM-Chk2-Cdc25C 通路修復，此通路可引起G2/M 期停滯，使腫瘤細胞有足夠的時間修復損傷的DNA[19]。在正常細胞周期中，Cdc25C 對細胞周期的調(diào)控是通過活化Cyclin B/-Cdc2 復合物使細胞由G2 期進入到M 期來調(diào)控的[11-12]。在分裂間期Cdc2 上的Tyr15和Thr14 存在抑制性磷酸化，該磷酸化狀態(tài)使Cyclin B/-Cdc2 復合物失活，使細胞無法分裂，而Cdc25C 則可使Tyr15 和Thr14 去磷酸化后活化，進而使細胞分裂[20]。Cdc25C 作為ATM-Chk2-Cdc25C 信號通路的下游底物，是G2/M 期檢查點的重要效應因子[21]。在細胞受到輻射損傷后，檢查點感受器ATM 感知DNA 損傷并活化，繼而磷酸化其下游底物Chk2，被磷酸化后的Chk2 使Cdc25C 上絲氨酸第216 位殘基發(fā)生抑制性磷酸化[22-23]，從而失去使Cdc2 去磷酸化后活化的能力，分裂進程因此被抑制，受損的細胞被阻滯在G2 期而獲得足夠的時間進行修復，從而增加腫瘤細胞對放射線的抵抗性[24]。

在前期研究中，構(gòu)建食管癌放療抵抗細胞（TE13-R），并發(fā)現(xiàn)Cdc25C 蛋白在TE13-R 細胞中表達上調(diào)，當利用Cdc25C干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TE13-R細胞后，可抑制Cdc25C 蛋白的表達，同時癌細胞放射抵抗消失。其結(jié)果提示Cdc25C 的表達與食管癌的放療抵抗密切相關(guān)，Cdc25C 的高表達可能增強食管癌對放射線的抗拒，Cdc25C 可能是食管癌放療敏感性相關(guān)基因。因此，為進一步明確Cdc25C 與食管癌放療抵抗的關(guān)系，本文收集臨床病例資料，采用免疫組織化學法檢測Cdc25C 在食管鱗癌組織中的表達情況，結(jié)果顯示Cdc25C 在食管鱗癌中高表達且與患者預后不良有關(guān)。

綜上所述，Cdc25C 表達水平可能與食管鱗狀細胞癌放療抵抗相關(guān)，Cdc25C 有望作為食管鱗癌放射治療中的潛在判斷預后的分子標志物，并可能具有預后判斷、監(jiān)測臨床療效的作用。但因本研究病例數(shù)較少，仍需開展大規(guī)模的臨床試驗及相關(guān)的細胞分子實驗加以證實。