張正衛(wèi)，楊一君

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 1.病理科，2.婦產(chǎn)科，江蘇 淮安 223001）

結(jié)直腸癌是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，每年約有120 萬新發(fā)病例，同時約有60 萬患者死于該病[1]。及時診斷和治療雖然降低了結(jié)直腸癌患者的病死率，但是患者的5年生存率仍然停留在60%～70%[2]，一大部分結(jié)直腸癌患者被確診時已經(jīng)處于進展期，局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因，因此預(yù)防和緩解結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移對改善患者的預(yù)后意義重大。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs, lncRNA）屬于長度＞200 個核苷酸的非編碼RNA，越來越多的研究報道lncRNAs 與細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲等密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用也愈發(fā)受到關(guān)注[3-5]，LncRNA 在多種類型腫瘤中異常表達，通過多種途徑影響腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[6-8]。lncRNA HSALNT0000015 是一個編碼289 個核苷酸的lncRNA，本研究通過檢測lncRNA HSALNT0000015 在結(jié)直腸癌組織和人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達，分析其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討lncRNA HSALNT0000015 與結(jié)直腸癌進展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，人結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo、SW480、HT-29、HCT 116 和正常人腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC 購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，敲減lncRNA HSALNT0000015 的質(zhì)粒和空載質(zhì)粒購自上海吉凱生物有限公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、MTT 試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）試劑盒和引物購自上海生工生物工程股份有限公司，Transwell 小室和Matrige 基質(zhì)購自美國Corning 公司，抗轉(zhuǎn)錄因子Slug、上皮鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH 抗體購自美國CST 公司，生存期結(jié)腸癌cDNAHColA095Su02 芯片購自上海芯超生物有限公司，手術(shù)標(biāo)本取自南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院結(jié)直腸癌患者，包括癌組織80 例，癌旁組織15 例。手術(shù)時間2006年2月—2010年2月，隨訪時間截至2015年9月。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116 和正常人腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC 培養(yǎng)于含5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由于結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達最高，選取對數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，參照轉(zhuǎn)染說明書進行操作，將HCT116 細(xì)胞以2×105個/孔接種于6 孔板，當(dāng)融合度達50%～60%時，分別將空白對照、陰性對照質(zhì)粒、siRNA 轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞設(shè)為空白組、對照組及實驗組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后更換培養(yǎng)基。

1.2.2 qRT-PCR 檢測lncRNA HSALNT0000015 水平使用Trizol 試劑提取細(xì)胞RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行檢測，以GAPDH 為內(nèi)參，檢測lncRNA HSALNT0000015 相對表達水平，lncRNA HSALNT00 00015 表達量取中位數(shù)，高于中位數(shù)定義為lncRNA HSALNT0000015 高表達，低于中位數(shù)定義為lncRNA HSALNT0000015 低表達。qRT-PCR反應(yīng)體系為： cDNA 模板2 μl，正、反向引物各1 μl，10×混合試劑2 μl，雙蒸水15 μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，共30 個循環(huán)。見表1。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116 細(xì)胞，消化收集細(xì)胞后將密度調(diào)整為0.5×104個/ml，以3×103個/孔接種于96 孔板。使用MTT 試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力，每孔加入MTT 溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處的光密度（OD）值，檢測第0、12、24、36 及72 小時的細(xì)胞增殖能力。實驗重復(fù)5 次。

1.2.4 Transwell 遷移/侵襲實驗檢測細(xì)胞遷移/侵襲能力取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116 細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個/ml，以0.4×103個/孔加入Transwell 小室，在下室中加入10% FBS 的500 μl 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后，使用甲醇固定，0.2%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，取4 個視野（100 倍）計數(shù)，實驗重復(fù)4 次。侵襲實驗： 在遷移實驗的基礎(chǔ)上在上室鋪Matrige 基質(zhì)，其余操作同遷移實驗。

表1 qRT-PCR 引物及siRNA 寡核苷酸序列

1.2.5 免疫印跡法檢測細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達水平取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116細(xì)胞，提取蛋白后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），一抗孵育過夜，二抗孵育1 h 后顯影。GAPDH為內(nèi)參，檢測E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白。實驗重復(fù)4 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。比較采用成組t檢驗、單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例表示，比較用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線，組間比較采用Log-rank χ2檢驗；多因素分析采用Cox 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達及與臨床病理特征的關(guān)系

lncRNA HSALNT0000015 在結(jié)直腸癌組織中相對表達量（6.890±0.180）與癌旁組織（2.127±0.242）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.062，P=0.000）；結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 高、低表達的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表達越高，腫瘤越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期越高；而年齡、性別及T 分期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

2.2 腫瘤組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者術(shù)后隨訪5 ～9年，死亡43 例，生存分析結(jié)果顯示，在Ⅰ、Ⅱ期（42 例）、Ⅲ、Ⅳ期（38 例）和Ⅰ～Ⅳ期（80 例）的結(jié)直腸癌患者中，lncRNA HSALNT0000015 高表達患者的總體生存率均低于lncRNA HSALNT0000015 低表達患者（χ2=60.241、14.820 和65.232，均P=0.000）。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT 0000015 高表達是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的危險因素[=16.289（95% CI： 6.950，38.179），P=0.000]。見圖1和表3、4。

2.3 空白組、對照組及實驗組細(xì)胞增殖能力比較

結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達高于正常人腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC（F=153.942，P=0.000），選擇HCT116細(xì)胞作為實驗細(xì)胞敲減lncRNA HSALNT0000015 的表達（見圖2A）。由于si-1 敲減效率最高（F=40.760，P=0.000），因此選擇si-1 作為實驗組細(xì)胞（見圖2B）。第0、12、24、48 和72 小時，空白組HCT116細(xì)胞的OD 值分別為（0.221±0.011）、（0.423±0.032）、（0.615±0.041）、（1.021±0.092）和（1.434±0.124），對照組HCT116 細(xì)胞的OD 值分別為（0.223±0.022）、（0.434±0.042）、（0.652±0.033）、（0.963±0.122）、（1.432±0.114），實驗組HCT116 細(xì)胞的OD 值分別為（0.201±0.032）、（0.184±0.022）、（0.291±0.062）、（0.383±0.032）、（0.501±0.042）。3 組不同時間點OD 值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點OD 值有差異（F=589.198，P=0.001）；②組間OD 值比較有差異（F=790.000，P=0.001），實驗組低于空白組和對照組；③3 組OD 值變化趨勢有差異（F=168.913，P=0.000）。見圖2C。

表2 結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

圖1 lncRNA HSALNT0000015 不同表達水平結(jié)直腸癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后因素的單因素分析參數(shù)

表4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后因素的多因素分析參數(shù)

圖2 敲減HSALNT0000015 后抑制HCT116 細(xì)胞的增殖能力

2.4 空白組、對照組及實驗組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

遷移實驗中，HCT116 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗組為（40.442±7.481）個/視野、空白組為（133.812±7.473）個/ 視野、對照組為（132.442±8.623）個/ 視野，3 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=737.991，P=0.000）。侵襲實驗中，HCT116 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗組為（18.562±2.941）個/視野、空白組為（55.942±7.683）個/視野和對照組為（54.313±7.684）個/視野，3 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=191.223，P=0.000）。見圖3。

2.5 空白組、對照組及實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白比較

3 組E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組HCT116 細(xì)胞E-cadherin 蛋白相對表達量高于空白組和對照組（P＜0.05），而Slug 和Vimentin 蛋白相對表達量低于空白組和對照組（P＜0.05）。見表5和圖4。

圖3 敲減HSALNT0000015 后抑制HCT116 細(xì)胞遷移和侵襲能力 （×100）

表5 3 組Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達量的比較 （±s）

表5 3 組Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達量的比較 （±s）

組別 Slug E-cadherin Vimentin空白組 0.693±0.035 0.550±0.030 0.997±0.180對照組 0.600±0.062 0.427±0.031 0.897±0.045實驗組 0.267±0.055 1.377±0.172 0.260±0.046 F 值 55.445 76.812 39.514 P 值 0.000 0.000 0.000

圖4 在HCT116 細(xì)胞中敲減lncRNA HSALNT0000015后對相關(guān)蛋白的影響

3 討論

lncRNA 可以作為miRNA 海綿結(jié)合并調(diào)控miRNA的功能，除此之外，lncRNA 也可以與蛋白質(zhì)相互作用增強或削弱其功能[4]，lncRNA 在腫瘤早期診斷和治療方面的潛力越來越受到關(guān)注[9-11]，lncRNA 可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。許多l(xiāng)ncRNA 如LINC01354、CPS1-IT1、RP11 在結(jié)直腸癌組織中異常高表達或低表達，發(fā)揮促癌作用或抑癌作用[6，12-13]。HSALNT0000015 是一種新發(fā)現(xiàn)的尚不清楚功能的lncRNA。

本研究結(jié)果表明，lncRNA HSALNT0000015 在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達水平高于癌旁組織和正常人腸上皮細(xì)胞，且隨著TNM 分期越高相對表達更高；此外，lncRNA HSALNT0000015 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中相對表達更高。敲減結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達水平后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均被抑制，以上結(jié)果提示lncRNA HSALNT0000015 可能參與調(diào)控結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程將上皮細(xì)胞重新編程使其具有間充質(zhì)表型，是增強腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[14]。已有許多研究報道lncRNA 通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進結(jié)直腸癌遷移和侵襲[15-17]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程由一系列轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，如Slug、Snail、Twist和Zed1/2 等，轉(zhuǎn)錄因子可以抑制E-cadherin 并誘導(dǎo)間充質(zhì)標(biāo)志物如N 型鈣黏蛋白、Vimentin 和纖連蛋白的表達[18-20]。本研究敲減結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達后，轉(zhuǎn)化因子Slug 和Vimentin 表達下調(diào)，E-cadherin 表達上升，表明lncRNA HSALNT0000015 可能是通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA HSALNT0000015 與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，Cox 回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的異常高表達是結(jié)直腸癌患者總體生存時間的危險因素，以上結(jié)果表明lncRNA HSALNT0000015 可以作為判斷結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述，HSALNT0000015 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中異常高表達，且其高表達可能與腫瘤增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期相關(guān)，敲減lncRNA HSALNT0000015 的表達可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能為lncRNA HSALNT0000015 通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，lncRNA HSALNT0000015 可能會為結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷和治療提供新的方向。