任春梅，許斌，鄒文蓉，彭鵬，文黎明

（四川綿陽四〇四醫(yī)院 1.消化內(nèi)科 2.感染科3.血液腫瘤科 四川 綿陽 621000）

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一[1]。胃癌早期癥狀隱匿，確診時多數(shù)患者已失去最佳的手術(shù)治療機會。胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的首要原因[2]，了解胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移機制對其臨床診療具有重要的意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation, EMT）是指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的生物學過程，腫瘤細胞發(fā)生EMT 后，細胞黏附性降低，具有更強的侵襲能力，是惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要途徑[3]。Wnt-1 誘導分泌蛋白2（Wnt-inducible secreted protein 2, WISP2）是CNN 家族成員之一，廣泛參與細胞增殖、分化、侵襲、間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成等多種生物學過程[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)WISP2 在多種組織和腫瘤中存在差異性表達，并正向或負向調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。本研究旨在探究WISP2 對胃癌細胞EMT 的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2018年5月四川綿陽四〇四醫(yī)院接收并行胃癌根治術(shù)的胃癌患者85 例，取其腫瘤組織和癌旁組織標本。其中，男性51 例，女性34 例；年齡34 ～77 歲，平均（56.7±5.7）歲；TNM 分期： Ⅰ期14 例，Ⅱ期29 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期15 例；分化程度： 高分化19 例，中分化29 例，低分化37 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例。納入標準： ①所有患者腫瘤組織標本經(jīng)病理學檢測確定為原發(fā)性胃癌；②所有患者術(shù)前未接受放療、化療等抗腫瘤治療；③所有患者臨床病理資料完整；④排除合并其他惡性腫瘤、重大臟器疾病和免疫性疾病的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者家屬術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學檢測WISP2 的表達及其判斷標準

組織標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。常規(guī)脫蠟、水化，檸檬酸鈉抗原修復液高壓加熱15 min，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，5% BAS 室溫封閉1 h。加入1 ∶50 稀釋的兔多克隆WISP2 抗體（英國Abcam 公司），4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，加入1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司），室溫孵育1 h。PBS 沖洗3 次，DAB 染色液（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）顯色，蘇木精-伊紅（HE）（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）復染，脫水透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察。判斷標準： 免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）結(jié)果由2 位病理醫(yī)師采用雙盲法評估，每張切片隨機選取5 個視野，綜合陽性細胞比例和染色強度判斷。陽性細胞比例： 陽性比例＜25%為1 分，25%～＜50%為2 分，50%～75%為3 分，＞75%為4 分；染色強度： 無著色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，黃褐色計3 分。陽性細胞比例和染色強度乘積0 ～2 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.3 WISP2 敲低穩(wěn)定細胞系構(gòu)建

WISP2-shRNA-GFP 或NC-shRNA-GFP慢病毒表達載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建）分別與輔助質(zhì)粒pMD2.0G 和pAXAS2 共轉(zhuǎn)293T 細胞，6 h 后更換培養(yǎng)基。48 h 后收集WISP2-shRNA 和NC-shRNA 病毒培養(yǎng)上清液，0.45 μm 濾器過濾，分別加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期、密度為70%的人胃癌細胞MGC80-3（武漢普諾賽生命科技公司）中，37℃、5%二氧化碳CO2感染48 h 后，更換含1 μg/ml 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行篩選，當顯微鏡下細胞均產(chǎn)生綠色熒光時表明細胞系構(gòu)建成功。

1.4 細胞劃痕實驗檢測WISP2 敲低對細胞遷移能力的影響

WISP2-shRNA 和NC-shRNA 慢病毒穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，重懸、計數(shù)并調(diào)整細胞密度至2.5×105個/ml，取2 ml 接種于6 孔板（6 孔板提前用Marker 筆在板背均勻地劃5 條間隔橫線），每組細胞設(shè)置3 個復孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜后，用1 ml 槍頭垂直于板背的橫線劃痕，PBS 洗3 次以去除被劃落的細胞，加入2 ml 無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在第0、6、12 及24 小時用細胞成像設(shè)備掃描讀板，采用Image J 分析劃痕修復情況。

1.5 Transwell 檢測WISP2 敲低對細胞侵襲能力的影響

WISP2-shRNA 和NC-shRNA 慢病毒穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，PBS 洗2 次，無血清培養(yǎng)基重懸、計數(shù)并調(diào)整細胞密度至5×105個/ml，取100 μl接種于Transwell 小室（美國Corning 公司）中，下室加入500 μl 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Transwell 小室用PBS 洗滌2 次，甲醇固定30 min。PBS 洗滌2 次后加入0.1%結(jié)晶紫（北京索萊寶生物科技公司）孵育20 min。PBS 洗滌2 次，并用棉簽輕微擦拭上層未遷移的細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞侵襲情況。

1.6 Western blotting 檢測WISP2 敲低對E-鈣黏蛋白、神經(jīng)-鈣黏蛋白和波形蛋白表達的影響

WISP2-shRNA 和NC-shRNA 慢病毒穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化并調(diào)整細胞密度至2.5×105個/ml，取2 ml 接種于6 孔板，過夜培養(yǎng)后，棄上清，PBS 洗1 次，加入RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）300 μl，冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心10 min，加入SDS 上樣緩沖液后煮沸10 min。SDSPAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA 封閉，加入1 ∶50 稀釋的WISP2 抗體（英國Abcam 公司），1 ∶200 稀釋的E- 鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司），1 ∶500 稀釋的神經(jīng)-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）和1 ∶500 稀釋的波形蛋白（Vimentin）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司），4℃孵育過夜。PBST 洗3 次，加入1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司），PBST 洗3 次。電化學發(fā)光（ECL）液顯影。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 WISP2 在胃癌組織和癌旁組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，WISP2 主要定位于細胞質(zhì)，在癌旁組織和胃癌組織中的陽性表達率分別為11.8%（10/85）和61.2%（52/85），兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.836，P=0.017），WISP2 在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織。見圖1。

2.2 WISP2 敲低對胃癌細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，NC-shRNA 組和WISP2-shRNA組細胞愈合程度分別為（84.74±9.61）%和（57.18±6.05）%，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.091，P=0.023），NC-shRNA 組細胞遷移能力高于WISP2-shRNA 組細胞。見圖2。

2.3 WISP2 敲低對胃癌細胞侵襲的影響

Transwell 統(tǒng)計結(jié)果表明，NC-shRNA 組和WISP2-shRNA 組細胞侵襲個數(shù)分別為（404.91±38.16）和（195.36±23.45）個，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.377，P=0.012），WISP2-shRNA 組細胞侵襲個數(shù)較NC-shRNA 組減少。見圖3。

圖1 WISP2 在胃癌組織和癌旁組織中的表達（免疫組織化學染色×200）

圖2 WISP2 敲低對胃癌細胞遷移能力的影響

圖3 WISP2 敲低對胃癌細胞侵襲能力的影響（0.1%結(jié)晶紫×400）

2.4 WISP2 敲低對胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的影響

兩組E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與NC-shRNA 組比較，WISP2-shRNA組細胞E-cadherin的相對表達量升高，Ncadherin 和Vimentin 的相對表達量降低。見表1和圖4。

表1 兩組WISP2、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 兩組WISP2、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin蛋白相對表達量比較 （±s）

組別 WISP2 E-cadherin N-cadherin Vimentin NC-shRNA 組 2.17±0.24 0.37±0.04 0.91±0.07 1.66±0.13 WISP2-shRNA組0.80±0.06 1.13±0.09 0.42±0.04 0.69±0.05 t 值 7.045 7.970 5.612 6.643 P 值 0.008 0.003 0.018 0.010

圖4 WISP2 敲低對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

CNN 家族包括富半胱氨酸蛋白61（CRY61）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、腎母細胞瘤過表達蛋白（NOV）以及Wnt 誘導的分泌蛋白WISP-1、WISP2、WISP-3 6 種具有高度同源性和保守性的基質(zhì)蛋白，在胚胎發(fā)育、血管生成、創(chuàng)傷修復、炎癥反應(yīng)、纖維化以及腫瘤疾病等多種病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[6-7]。WISP2 又稱CNN5，是一種長度為250 個氨基酸、富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽，在調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附以及遷移過程中起著重要作用[8]。WISP2 的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如FRITAH 的研究[9]顯示，WISP2 是參與維持乳腺癌上皮細胞分化表型的重要調(diào)節(jié)因子，并在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用；DAVIES 等[10]證明WISP2 在結(jié)直腸癌細胞表達水平低于正常組織，且與正常組織比較，高侵襲性腫瘤的表達水平更低；DHAR 的研究[11]則顯示W(wǎng)ISP2 在胰腺癌呈低表達，并密切參與胰腺癌的發(fā)生和進展。本研究發(fā)現(xiàn)，WISP2 在胃癌組織和癌旁組織中表達差異有統(tǒng)計學意義，且在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，這與LI 等[12]的研究結(jié)果一致，提示W(wǎng)ISP2 可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。

WISP2 的表達對胃癌細胞生物學功能的影響。本研究結(jié)果顯示，與NC-shRNA 組細胞比較，WISP2-shRNA 組細胞遷移能力下降，細胞劃痕愈合較慢；此外，WISP2-shRNA 組細胞侵襲數(shù)較NC-shRNA 組少。WISP2 下調(diào)可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，在腫瘤的生長過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因、多水平、多步驟的復雜調(diào)控過程。研究顯示，EMT 的發(fā)生與胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]。EMT 發(fā)生后，腫瘤細胞間的黏附力下降，遷移和運動能力增強，腫瘤細胞更易脫離原發(fā)灶進入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)，進而導致遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，已被視為促進腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制[15]。EMT 的發(fā)生和調(diào)節(jié)涉及一系列的復雜信號傳導通路，最終體現(xiàn)在上皮細胞標志蛋白E-cadherin、角蛋白的下降，以及間質(zhì)細胞標志蛋白N-cadherin、Vimentin 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的增加[16]。E-cadherin屬鈣黏蛋白家族成員，主要介導細胞連接與黏附，其表達缺失與多種上皮惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。N-cadherin 和Vimentin 是間質(zhì)細胞的重要標志蛋白，其高表達與多種惡性腫瘤的增殖、浸潤以及預(yù)后不良存在相關(guān)性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC-shRNA 組比較，WISP2-shRNA 組細胞E-cadherin 的表達水平升高，N-cadherin 和Vimentin 的表達水平下降，提示W(wǎng)ISP2 的沉默可通過調(diào)控胃癌細胞的EMT 進程，進而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，WISP2 在胃癌組織中的高表達，WISP2的下調(diào)可抑制胃癌細胞的EMT 和轉(zhuǎn)移過程，但WISP2參與調(diào)控EMT 的具體分子機制仍待后續(xù)的深入研究。