孔曉玲，張曉梅，洪偉偉，張琰，沈波，程艷萍，楊圣，梁戈玉

（1.東南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009）

結(jié)腸直腸癌是世界上常見的癌癥類型之一[1]。近10年來，中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率迅速上升[2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年中國結(jié)腸直腸癌新發(fā)病例約37.0 萬，死亡病例約18.0 萬，分別居惡性腫瘤第3 和第5 位[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)病和進(jìn)展與個體遺傳差異密切相關(guān)，因此尋找與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物能為判斷或預(yù)測腫瘤進(jìn)展提供分子水平依據(jù)。代謝酶是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要組成部分，參與各種生命活動和過程。已有研究報(bào)道，代謝酶基因多態(tài)性可能影響基因、蛋白表達(dá)以及酶活性，影響物質(zhì)代謝過程，從而改變生物體的暴露，最終影響結(jié)直腸癌的發(fā)病、治療和預(yù)后。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）代表1個Ⅱ相解毒酶超家族，參與內(nèi)源外源活性物質(zhì)的代謝。其作用機(jī)制為GST 酶催化谷胱甘肽與親電物質(zhì)結(jié)合，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性代謝物，從而消除有害物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)GST 酶可促進(jìn)各種致癌物質(zhì)、治療藥物、環(huán)境毒素和氧化應(yīng)激產(chǎn)物的解毒。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3（GSTM3）rs7483 位于編碼區(qū)，該單核苷酸多態(tài)性（single nueleotide polymorphism,SNP）能影響GSTM3 酶活性[4]，但目前尚無GSTM3 rs7483 與結(jié)直腸癌進(jìn)展的相關(guān)報(bào)道。二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD）由二氫嘧啶脫氫酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene, DPYD）編碼，是調(diào)節(jié)胸腺嘧啶或尿嘧啶等的第1 階段代謝酶，其代謝受阻可導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性效應(yīng)，如RNA 或DNA損傷[5]。rs1801159 是位于DPYD 編碼區(qū)的SNP，能導(dǎo)致密碼子543 處的異亮氨酸翻譯成纈氨酸。研究報(bào)道稱rs1801159 能降低DPD 活性，可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)[6]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase, UGT）廣泛表達(dá)于肝臟、胃和腸道等組織。研究表明，當(dāng)UGT基因發(fā)生變異，酶活性可能降低或喪失，導(dǎo)致內(nèi)外源性化合物與結(jié)腸黏膜組織葡萄糖醛酸的結(jié)合能力降低，解毒減少，致癌物的暴露增加，可能影響胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等癌癥的發(fā)病、進(jìn)展和預(yù)后[7-8]。

本研究通過NCBI dbSNP 數(shù)據(jù)庫，選擇與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)的代謝酶基因，并在中國漢族人群中選擇次要等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）＞20%的3 個候選SNPs，分別是GSTM3 rs7483、DPYD rs1801159 和UDP 葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1 家族多 肽A1（UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1）rs3755319，研究候選SNPs 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月—2017年7月江蘇省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸癌患者外周血690 份。其中，男性427 例，女性263 例；平均年齡（57.83±11.64）歲；平均BMI（23.03±2.91）kg/m2。由于48 例缺少分化程度資料，只分析了642 例患者的基因多態(tài)性與分化程度的關(guān)系。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①研究對象同意參加本研究；②經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌患者；③年齡、性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①同時患其他腫瘤或有腫瘤史者；②經(jīng)診斷患嚴(yán)重的消化道疾病或嚴(yán)重心腦血管疾病等疾病者。每人抽取2 ml 外周靜脈血于抗凝管，然后置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN 公司），2×Hot Taq @ PCR Reaction Mix（美國Stegene Bio Technoloaies 公司），探針和引物由南京驥驁生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。Step One PlusTMPCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），Nano Drop ND-1000 微量分光光度計(jì)（美國Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取外周血基因組DNA使用QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒從外周血中提取基因組DNA，操作過程按照說明書步驟進(jìn)行，提取的DNA于-20℃冰箱冷凍保存。采用Nano Drop ND-1000 微量分光光度計(jì)測定DNA 濃度和純度。

1.3.2 基因分型采用TaqMan -MGB實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行基因分型，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μl，內(nèi)含2×TaqMan Master Mix 5.0 μl，正、反向引物各0.45 μl，TaqMan FAM 探針、Taq Man HE×探針各0.25 μl，模板DNA 1.0 μl 及無酶水2.6 μl。GSTM3 rs7483 正向引物： 5'-CAAGATGCCCATCAACAACAA-3'，反向引物： 5'-GA AACAAAACAAGCTCTGCAAGTC-3'，長度21 bp；DPYD rs1801159 正向引物： 5'-TTGATCTGGTGGACATTAGT GTAGAAA-3'，反向引物： 5'-CTGGAGTTGCGCTAGC AAGA-3'，長度27 bp；UGT1A1 rs3755319，正向引物： 5'-CAATACTTGCCCCATAGTCCATG-3'，反向引物： 5'-TACTCATTCCACTGGCCCAAGAT-3'，長 度23 bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40 個循環(huán)。最后60℃延伸30 s。以未加DNA 模版的無酶水反應(yīng)體系作為對照組。為驗(yàn)證PCR 基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取部分樣品送南京驥驁生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。3 個位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系采用Logistic 回歸分析，以比值比（）和95%可信區(qū)間（95% CI）估計(jì)各研究因素與結(jié)直腸癌進(jìn)展的關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 基因分型結(jié)果

3 個位點(diǎn)的基因分型結(jié)果見圖1。由于UGT1A1 rs3755319 位點(diǎn)采用反向測序法，故AA 對應(yīng)TT 基因型，AC 對應(yīng)GT 基因型，CC 對應(yīng)GG 基因型。測序結(jié)果與TaqMan-MGB 探針法的SNP 分型結(jié)果完全一致。

圖1 3 個位點(diǎn)PCR 基因分型圖與測序圖

2.2 GSTM3 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1 GSTM3 rs7483 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響隱性模型中GSTM3 rs7483 GG 基因型在Ⅰ、Ⅱ期的頻率高于Ⅲ、Ⅳ期[GG VS AA+GA：=0.466（95% CI： 0.261，0.834），P=0.010]。見表1。

2.2.2 分層分析GSTM3 rs7483 對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響對年齡進(jìn)行分層，低齡患者（≤60 歲）GSTM3 rs7483 多態(tài)性與臨床病理特征無關(guān)；在高齡患者（＞60 歲）中，隱性模型中攜帶GG 基因型患者Ⅰ、Ⅱ期腫瘤比例是AA+GA 基因型的0.321 倍[GG VS AA+GA：=0.321（95% CI： 0.126，0.821），P=0.018]（見表2）。對性別進(jìn)行分層，結(jié)果發(fā)現(xiàn)性別GSTM3 rs7483 與臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）（見表3）。

2.3 DPYD 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3.1 DPYD rs1801159 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響顯性模型中，AG+GG 基因型患者低分化腫瘤的比例是AA 基因型的1.398 倍[AG+GG VS AA：=1.398（95% CI： 1.004，1.946），P=0.047]。見表4。

2.3.2 分層分析DPYD rs1801159 對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響對年齡進(jìn)行分層，≤60 歲人群中，與AA型比較，AG+GG 基因型患者低分化腫瘤的頻率高于中高分化[AG+GG VS AA：=1.775（95% CI： 1.132，2.785），P=0.012]，此外高齡患者中DPYD rs1801159基因型與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）（見表5）。對性別進(jìn)行分層，發(fā)現(xiàn)女性結(jié)直腸癌患者DPYD rs1801159 與腫瘤分化程度有關(guān)系，低分化組中AG+GG 基因型的頻率高于中高分化組[（AG+GG VS AA：=2.092（95% CI： 1.218，3.595），P=0.008]。此外，男性結(jié)直腸癌患者DPYD rs1801159 與臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）（見表6）。

表1 GSTM3 rs7483 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 年齡分層GSTM3 rs7483 與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 UGT1A1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

在UGT1A1 rs3755319 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床進(jìn)展的影響中發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。見表7。

表3 性別分層GSTM3 rs7483 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例（%）

表4 DPYD rs1801159 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表5 年齡分層DPYD rs1801159 與臨床病理特征的關(guān)系

表6 性別分層DPYD rs1801159 與臨床病理特征的關(guān)系

表7 UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表7

3 討論

結(jié)直腸癌作為全球發(fā)病率和致死率很高的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為危害人類健康的重大疾病[9]。基因多態(tài)性是人類基因組中最豐富的遺傳變異，其可能導(dǎo)致個體對環(huán)境應(yīng)答、機(jī)體損傷反應(yīng)性、各種疾病易感性以及疾病進(jìn)展的差異[10]。代謝酶是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要組成部分，參與各種生命活動和過程。

目前關(guān)于UGT1A1 rs3755319 的研究報(bào)道極少，其與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚不明確。SHIN 等[11]通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319可能改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，降低基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，接受FOLFORI（5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣、伊立替康和奧沙利鉑）化療方案的晚期結(jié)直腸癌患者，UGT1A1 rs3755319 GG 比TT基因型發(fā)生3、4 級 中性粒細(xì)胞減少的毒性反應(yīng)高9 倍，可能因?yàn)镚G 基因型降低UGT1A1 酶活性，導(dǎo)致化療藥物代謝減少，體內(nèi)蓄積引起副作用[12]。本研究首次分析UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關(guān)。

目前關(guān)于GSTM3 rs7483 的研究較少，與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚未闡明。MAES 等[13]研究GSTM3 與阿爾茨海默病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GSTM3 rs7483 A 等位基因存在或者G 等位基因的缺失會降低GSTM3 mRNA 的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶GSTM3 rs7483 GG 基因型患者與Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌有關(guān)，尤其與高齡患者Ⅰ、Ⅱ分期有關(guān)，提示腫瘤進(jìn)展較慢。研究表明GST 可促進(jìn)各種致癌物質(zhì)、治療藥物、環(huán)境毒素的解毒，因而可能延緩疾病進(jìn)展，TAN 等[14]發(fā)現(xiàn)GSTM3 在腎細(xì)胞癌中具有抑制腫瘤的作用，rs1332018 基因變異使宿主下調(diào)腎臟中GSTM3 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，預(yù)測腎細(xì)胞癌術(shù)后不良預(yù)后。SHIOTA 等[15]研究表明，與AA 基因型比較，GG+AG 型與前列腺癌進(jìn)展減慢相關(guān)。上述研究均表明GSTM3 發(fā)揮著延緩疾病進(jìn)展的作用，本研究結(jié)論在一定程度上與上述結(jié)果一致。然而MEDING 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GSTM3 在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者組織中高表達(dá)。本研究與該研究結(jié)論不一致，目前關(guān)于GSTM3 與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的研究僅有MEDING 等報(bào)道，需要進(jìn)行更多的探索。綜上研究，結(jié)合本研究結(jié)果，可能由于GSTM3 rs7483 GG 基因型使GSTM3 表達(dá)水平升高，在GSTM3 酶的作用下，各種致癌物和環(huán)境毒素被轉(zhuǎn)化成親水性代謝物排出體外，因而減少淋巴轉(zhuǎn)移，延緩結(jié)直腸癌的進(jìn)展。本研究首次發(fā)現(xiàn)GSTM3 rs7483 GG 基因型患者多為Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌，提示GG 基因型攜帶者疾病進(jìn)展可能較慢。

研究顯示，DPYD 基因多態(tài)性影響DPD 的活性[17]。SHAUL 等[18]研究發(fā)現(xiàn)DPD 在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，可能是腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一。ZHANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)DPYD rs1801159A＞G 降低DPD 活性，影響機(jī)體代謝化療藥物，導(dǎo)致化療藥物在體內(nèi)蓄積引起毒性反應(yīng)。QIN 等[19]發(fā)現(xiàn)接受化療的乳腺癌患者中，DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型患者的OS 和無疾病進(jìn)展期比AA 基因型患者短。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶AG和GG 基因型患者與低分化腫瘤有關(guān)，尤其與低齡和女性患者的低分化有關(guān)。可能是由于AG 和GG 基因型降低DPD 酶活性，進(jìn)而影響化療藥物代謝，毒物在體內(nèi)蓄積從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的惡化。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)攜帶GSTM3 rs7483 GG 基因型結(jié)直腸癌患者多為Ⅰ、Ⅱ分期，且BMI 低下，GG 基因型攜帶者在Ⅰ、Ⅱ期中的頻率高于Ⅲ、Ⅳ期，提示GG 基因型攜帶者疾病進(jìn)展可能較慢。本研究還發(fā)現(xiàn)DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型攜帶者呈現(xiàn)低分化，提示疾病進(jìn)展可能較快，這為結(jié)直腸癌的早期預(yù)防提供依據(jù)。但由于不同種族基因型分布存在差異，部分候選SNPs 的具體分子作用機(jī)制有待深入研究，所得結(jié)論也有待更進(jìn)一步的佐證。因此，在今后的研究中需要開展更大規(guī)模的人群流行病學(xué)調(diào)查，并綜合考慮基因與環(huán)境的協(xié)同作用，明確SNPs 的分子機(jī)制，為判斷或預(yù)測結(jié)直腸癌進(jìn)展提供分子水平依據(jù)。