陸盈，孫順昌

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院 檢驗(yàn)科，上海 201801）

脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia, SCA）是一組臨床和遺傳均具異質(zhì)性的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為小腦性共濟(jì)失調(diào)，可伴有構(gòu)音障礙、意向性震顫、眼球運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀[1]。SCA 遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X-連鎖隱性遺傳等模式，以常染色體顯性遺傳為主[2]。目前臨床已發(fā)現(xiàn)30 多型SCA，其中大部分型SCA 的致病基因已被確定[3]。研究發(fā)現(xiàn)，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17 和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥（dentatorubral-pallidoluysian atrophy,DRPLA）等亞型是由基因編碼區(qū)CAG 三核苷酸重復(fù)序列的拷貝數(shù)增加所致，而CAG 編碼的氨基酸為谷氨酰胺，因此該亞型SCA 又稱(chēng)為多聚谷氨酰胺病，即PolyQ 病[4]。SCA1 致病機(jī)制仍不完全清楚，有研究顯示SCA1 發(fā)病與突變產(chǎn)物的堆積有關(guān)，也有研究顯示SCA1 發(fā)病與正常失調(diào)蛋白（Ataxin-1）的功能缺失有關(guān)，Ataxin-1 是ATXN1基因的表達(dá)產(chǎn)物[5]。本研究通過(guò)構(gòu)建正常和突變的ATXN1基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)正常和突變ATXN1 mRNA 的水平，分析ATXN1基因內(nèi)PolyQ 重復(fù)數(shù)的增加對(duì)基因自身轉(zhuǎn)錄的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SW-CJ-1D 型超凈工作臺(tái)和BHC-1300IIA/B3 型生物安全柜（蘇州江蘇蘇靜集團(tuán)），3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱和ST16R 型低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司），MF51 型倒置顯微鏡（廣州明美光電公司），ABI7500 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）擴(kuò)增儀（美國(guó)Life technology 公司），SMA4000 型超微量分光光度計(jì)（北京Merinton 公司），Bestar 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR 擴(kuò)增試劑盒（德國(guó)DBI 公司），引物由Life technology 公司合成，人胚腎細(xì)胞（293T 細(xì)胞）和大腸桿菌Stbl3（廣州輝駿生物科技有限公司），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司），BC117125.1 克隆質(zhì)粒和pLVX-Puro-3xflag-C、pMD2.G 及psPAX2 載體（廣州輝駿生物科技有限公司），ATXN1-MUT 基因由廣州輝駿生物科技有限公司合成。

1.2 pLVX-Puro-3xflag-ATXN1 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

以BC117125.1 克隆質(zhì)粒為模板擴(kuò)增正常ATXN1基因（ATXN1-WT），突變ATXN1基因（ATXN1-MUT）通過(guò)化學(xué)合成。ATXN1-WT 和ATXN1-MUT 用核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，再用T4 DNA連接酶接到pLVX-Puro-3xflag-C 載體上構(gòu)建pLVXPuro-3xflag-ATXN1-WT（野生）和pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-MUT（突變）表達(dá)載體。同時(shí)以pLVX-Puro-3xflag-C 空載體為載體對(duì)照。將構(gòu)建的野生型和突變型表達(dá)載體，以及載體對(duì)照分別導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌Stbl3 中進(jìn)行克隆，收集菌液并抽提質(zhì)粒。通過(guò)核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切及測(cè)序鑒定構(gòu)建的野生型和突變型ATXN1表達(dá)載體。

1.3 ATXN1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選及鑒定

將包裝質(zhì)粒和上述經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-WT 或pLVX-Puro-3xflag-ATXN1-MUT表達(dá)載體質(zhì)粒及載體對(duì)照分別共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，并用超速離心法進(jìn)行純化。在Polybrene 介導(dǎo)下，用重組慢病毒顆粒感染293T 細(xì)胞，用Puromycin 篩選穩(wěn)定表達(dá)野生和突變Ataxin-1 蛋白的細(xì)胞株，通過(guò)Western blotting 鑒定表達(dá)的野生和突變Ataxin-1 蛋白。將穩(wěn)定表達(dá)野生和突變Ataxin-1 蛋白的細(xì)胞株和攜帶載體對(duì)照的293T 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)ATXN1 mRNA 的表達(dá)水平。

1.4 ATXN1 轉(zhuǎn)錄檢測(cè)方法的建立

依據(jù)Trizol RNA 分離試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA，并溶解于無(wú)RNA 酶的滅菌水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度。將RNA 溶液加入到gDNA吸附柱，室溫13 200 r/min 離心1 min，過(guò)柱，收集的濾液即為去除基因組DNA 的RNA 溶液。依據(jù)Bestar逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA 備用。依據(jù)ATXN1序列（NM_001128164）和GAPDH序列（NM_002046.3），使用Primer 3 在線(xiàn)軟件（http://primer3.ut.ee/），分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增ATXN1 和GAPDH cDNA 的引物（見(jiàn)表1），分別擴(kuò)增目的基因ATXN1和內(nèi)參基因GAPDH，表達(dá)野生和突變Ataxin-1 的細(xì)胞株分設(shè)3 份，293T 細(xì)胞和攜帶載體對(duì)照的293T 細(xì)胞也分設(shè)3 份，4 組同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的擴(kuò)增體系配置擴(kuò)增反應(yīng)液。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，共45 個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括95℃變性10 s，60℃退火34 s（采集熒光信號(hào)），72℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后從60℃升溫到98℃獲取熔解曲線(xiàn)。以GAPDH 擴(kuò)增Ct 值（熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為參考，計(jì)算ATXN1基因表達(dá)的相對(duì)量（-△Ct）=ATXN1基因Ct 值均值-GAPDH基因Ct 值均值。野生型和突變型ATXN1表達(dá)量差異（-△△Ct）=-△Ct 野生型-（-△Ct突變型）。

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物

1.5 ATXN1 轉(zhuǎn)錄檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)，本研究將野生ATXN1和突變ATXN1表達(dá)載體導(dǎo)入293T 細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)正常ATXN1 和突變ATXN1 的mRNA 水平。通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)判斷ATXN1和GAPDH基因是否成功擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增后熔解曲線(xiàn)分析判斷ATXN1和GAPDH基因擴(kuò)增是否為特異擴(kuò)增。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。細(xì)胞內(nèi)野生型和突變型ATXN1相對(duì)表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATXN1 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)方法建立成功

ATXN1和GAPDH基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S 形，顯示擴(kuò)增方法成功（見(jiàn)圖1），擴(kuò)增后熔解曲線(xiàn)分析顯示ATXN1和GAPDH基因的熔解曲線(xiàn)峰值分別在X 軸同一位點(diǎn)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物分別為均一性產(chǎn)物，即擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增（見(jiàn)圖2）。因此本研究的擴(kuò)增方法可用于對(duì)ATXN1 mRNA 進(jìn)行相對(duì)定量。

圖1 GAPDH 和ATXN1 基因擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖2 GAPDH 和ATXN1 基因的熔解曲線(xiàn)

2.2 ATXN1 基因內(nèi)PolyQ 重復(fù)變異對(duì)基因自身轉(zhuǎn)錄的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)293T 細(xì)胞內(nèi)正常ATXN1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為（661.9±17.7），而突變ATXN1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為（381.0±20.5），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.950，P=0.006），正常ATXN1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高于突變ATXN1 mRNA，正常293T 細(xì)胞和僅轉(zhuǎn)染載體對(duì)照的293T 細(xì)胞中ATXN1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.0±0.1）和（0.3±0.0）。

3 討論

ATXN1基因定位于6p23，基因全長(zhǎng)約450 kb，含9 個(gè)外顯子，表達(dá)產(chǎn)物為Ataxin-1 蛋白。在A(yíng)TXN1基因外顯子7 中存在一段CAG 三核苷酸重復(fù)序列，正常人群中重復(fù)數(shù)為6 ～44，且多被1 ～4 個(gè)編碼組氨酸的CAT 序列隔開(kāi)[6]。SCA1 是ATXN1基因外顯子7 中的CAG 重復(fù)序列拷貝數(shù)增加所致的退行性疾病，CAG重復(fù)序列數(shù)越多，患者的發(fā)病年齡越早，疾病越嚴(yán)重。CAG 重復(fù)序列數(shù)增加致SCA1 的機(jī)制目前尚不完全清楚[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠被敲除ATXN1基因后并未出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)癥狀或浦肯野細(xì)胞的病理改變；另有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠和果蠅體內(nèi)過(guò)度表達(dá)PolyQ 超出正常長(zhǎng)度的Ataxin-1 會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變，甚至在小鼠和果蠅體內(nèi)過(guò)度表達(dá)正常的Ataxin-1 蛋白也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性改變，只是病變程度較突變Ataxin-1 蛋白所致輕[8]。因此，SCA1 發(fā)病的分子機(jī)制與突變產(chǎn)物毒性功能獲得有關(guān)。在A(yíng)TXN1基因雜合突變小鼠體內(nèi)，若再敲除另一拷貝的正常ATXN1基因，小鼠的SCA1癥狀會(huì)進(jìn)一步加重，這顯示正常Ataxin-1 蛋白功能的丟失也可能與SCA1 發(fā)病有關(guān)[9]?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，SCA1 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，既有突變蛋白的毒性功能獲得，也有野生蛋白的功能缺失[10]。此外，SCA1 的發(fā)病可能還與Ataxin-1 蛋白的修飾有關(guān)，Ataxin-1 蛋白翻譯后需經(jīng)修飾才具有生物功能，這些修飾有磷酸化、泛素化、類(lèi)泛素化、轉(zhuǎn)谷氨酰胺等，這些修飾能改變Ataxin-1 蛋白的穩(wěn)定性或Ataxin-1 蛋白對(duì)靶基因的調(diào)控能力，導(dǎo)致SCA1 病，如Ataxin-1 蛋白776 位絲氨酸殘基通過(guò)Akt 激酶被磷酸化，可與14-3-3 蛋白作用形成包涵體，使神經(jīng)元發(fā)生退行性改變，Ataxin-1分子中PolyQ 長(zhǎng)度越長(zhǎng)，Ataxin-1 與14-3-3 蛋白作用愈強(qiáng)[11]。

一般認(rèn)為Ataxin-1 蛋白為轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子有Capicua、HDAC3、Gfi-1 等[12]。ATXN1基因外顯子7 中的CAG 重復(fù)序列拷貝數(shù)增加會(huì)影響其調(diào)控的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，但對(duì)ATXN1基因自身轉(zhuǎn)錄是否產(chǎn)生影響，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，突變ATXN1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量低于正常ATXN1基因。以往研究顯示，Ataxin-1蛋白有3 段氨基酸殘基結(jié)構(gòu)與SCA1 發(fā)病密切相關(guān)，它們分別是PolyQ 結(jié)構(gòu)段、AXH 結(jié)構(gòu)段及近C 端的NLS 結(jié)構(gòu)段[13]。PolyQ 延伸是SCA1 發(fā)病的基礎(chǔ)，AXH 肽段結(jié)構(gòu)中570 ～689 位氨基酸對(duì)Ataxin-1 蛋白聚集作用是SCA1 發(fā)病的因素之一，NLS 結(jié)構(gòu)段引導(dǎo)Ataxin-1 蛋白進(jìn)入胞核也是SCA1 發(fā)病的一個(gè)因素[14]。本研究顯示，PolyQ 延伸同時(shí)導(dǎo)致ATXN1基因轉(zhuǎn)錄量減少，推測(cè)ATXN1基因內(nèi)PolyQ 重復(fù)變異抑制ATXN1基因自身轉(zhuǎn)錄可能對(duì)SCA1 發(fā)病產(chǎn)生影響，突變的Ataxin-1 量減少，則進(jìn)入胞核的突變Ataxin-1減少，理論上可減輕SCA1 發(fā)病。因此，本研究認(rèn)為PolyQ 延伸可通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄，減輕SCA1 發(fā)病。