楊國棟，陳詩強，趙樂

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院a.血管外科;b.檢驗科，河南 洛陽 471003)

髂股動脈硬化閉塞是臨床較常見的一種下肢血管性疾病，是在髂股動脈粥樣硬化的基礎上引起的下肢動脈慢性狹窄閉塞，從而導致下肢的慢性缺血。早期臨床表現(xiàn)主要為患側肢體蒼白、冷感，然后出現(xiàn)缺血性疼痛、間歇跛行、肢端潰瘍壞疽。該疾病大多合并有心腦血管疾病，治療風險大，致殘率和致死率較高[1-2]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA) ANRIL是一條從染色體9p21.3轉錄而來的lncRNA，長度為3.8 kb，參與調控血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展，在動脈粥樣硬化的進程中不可或缺[3-5]。本研究擬通過觀察lncRNA ANRIL在髂股動脈硬化閉塞患者中的表達，分析其在髂股動脈硬化閉塞發(fā)生、發(fā)展中的作用以及髂股動脈硬化閉塞的臨床危險因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年3月至2019年8月在河南科技大學第一附屬醫(yī)院接受髂股動脈粥樣硬化斑塊內膜剝脫術治療的98例患者的新鮮組織標本，其中穩(wěn)定斑塊組(55例)、不穩(wěn)定斑塊組(43例)以及對照組(36例)。穩(wěn)定斑塊組：男34例，女21例；年齡56～82歲，中位年齡65歲；吸煙者35例，不吸煙者20例；患原發(fā)性高血壓者23例，無原發(fā)性高血壓者32例；糖尿病者18例，無糖尿病者37例。不穩(wěn)定斑塊組：男23例，女20例；年齡53～86歲，中位年齡66歲；吸煙者18例，不吸煙者25例；患原發(fā)性高血壓者20例，無原發(fā)性高血壓者23例；糖尿病者16例，無糖尿病者27例。對照組(脾臟切除術顯示脾動脈正常)：男27例，女9例；年齡43～63歲，中位年齡46歲；吸煙者21例，不吸煙者15例；患原發(fā)性高血壓者9例，無原發(fā)性高血壓者27例；糖尿病者6例，無糖尿病者30例。3組患者性別、年齡、吸煙、原發(fā)性高血壓、糖尿病情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性?；颊咦栽竻⑴c本研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)河南科技大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。所有入選患者組織斑塊標本在離體0.5 h內固定于100 g·L-1的多聚甲醛中，置于-80 ℃冰箱內備用。

1.2 試劑總RNA提取試劑盒購于invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自TaKaRa公司，上下游引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測lncRNA ANRIL mRNA的表達采用TRIzol法提取總RNA。嚴格按試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。以磷酸甘油醛脫氫酶為內參，反應體系30 μL，條件95 ℃變性10 min，95 ℃ 5 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。反應結束后，采用2×SYBR Green PCR Master Mix進行qRT-PCR。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

2 結果

2.1 lncRNA ANRIL的表達lncRNA ANRIL在對照組中的表達量(0.23±0.03)低于穩(wěn)定斑塊組(0.66±0.02)及不穩(wěn)定斑塊組(1.33±0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.2 斑塊組lncRNA ANRIL的表達與臨床因素的關系年齡、性別、吸煙、飲酒均與lncRNA ANRIL的表達無關(均P>0.05)，高血壓、糖尿病均與lncRNA ANRIL的表達有關(均P<0.05)。見表2。

表2 lncRNA ANRIL的表達與臨床因素的關系

2.3 髂股動脈粥樣硬化閉塞獨立危險因素的logistic回歸模型多因素分析發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病及l(fā)ncRNA ANRIL表達水平均是髂股動脈粥樣硬化閉塞的獨立危險因素(均P<0.05)。見表3。

表3 髂股動脈粥樣硬化閉塞獨立危險因素的logistic回歸模型結果

3 討論

隨著中國人口老齡化的進一步加劇及生活水平的提高，動脈粥樣硬化所導致的心腦血管意外和外周動脈硬化閉塞等一系列疾病已經(jīng)嚴重威脅到居民的生命安全和生活質量。盡管醫(yī)療技術的迅速發(fā)展使患者經(jīng)過治療后癥狀能夠得到緩解，生活質量得到提升，但無法從根本上逆轉或阻止其進一步發(fā)展。動脈粥樣硬化的一個重要發(fā)病機制就是血管平滑肌細胞的增殖和遷移，其遷移和增殖導致了血管的狹窄和痙攣，是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的病理基礎。

lncRNA是一類長度超過200 nt但不參與蛋白編碼過程的RNA[6]。按鄰近基因的位置和方向的差異性可以將lncRNA分成基因內、基因間、正義、反義、雙向5種類型[7]。lncRNA ANRIL是腫瘤抑制基因INK4b-ARF-INK4a基因簇轉錄而形成的反義RNA，又稱CDKN2B的反義RNA或P15的反義RNA。ANRIL位于染色體9p21.3上不包含任何已知蛋白編碼基因的序列上，長度約3.8 kb，含有20個外顯子[8]。ANRIL位于INK4基因座上，可轉錄成與INK4b-AFR-INK4a基因座呈轉錄反方向的RNA，作用于位于ARF基因轉錄起始位點上游約300 bps的1個外顯子的5’端，從而導致INK4位點的基因沉默，促進血管平滑肌細胞增殖和動脈粥樣斑塊形成。ANRIL位于內皮細胞、免疫細胞和平滑肌細胞等多種類型的細胞中，在人體內多種正常組織中均有表達。不同組織中ANRIL的表達有差異，尤其在動脈粥樣硬化斑塊、外周血單核細胞中水平較高[9]。有研究表明，lncRNA ANRIL能夠通過調控血管平滑肌細胞引起動脈粥樣硬化改變。ANRIL還可通過反向調控靶基因，增加血管平滑肌細胞的增殖、黏附，減少細胞凋亡。

本研究通過qRT-PCR法檢測對照組、穩(wěn)定斑塊組和不穩(wěn)定斑塊組中l(wèi)ncRNA ANRIL的表達量，結果顯示，lncRNA ANRIL在無斑塊組中的表達量低于有斑塊組，在穩(wěn)定斑塊組中的表達量又低于不穩(wěn)定斑塊組，即隨著斑塊的形成及斑塊不穩(wěn)定性增加，lncRNA ANRIL的表達量升高，提示lncRNA ANRIL參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成與發(fā)展。Holdt等[10]發(fā)現(xiàn)，頸動脈硬化斑塊中l(wèi)ncRNA ANRIL的表達量與頸動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關。全基因組關聯(lián)研究也表明，位于ANRIL基因的單核苷酸多態(tài)性與動脈粥樣硬化的易感性密切相關[11]，同時也是冠狀動脈相關疾病中遺傳易感性最強的位點[12]。ANRIL能招募PRC1和PRC2調節(jié)INK4b-ARF-INK4a基因簇的表達，影響心血管疾病的易感性[13]。本研究結果顯示，lncRNA ANRIL的表達與性別、年齡、吸煙、飲酒無關，與高血壓、糖尿病有關。多因素分析發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病及l(fā)ncRNA ANRIL表達水平是髂股動脈粥樣硬化閉塞的獨立危險因素。

總之，lncRNA ANRIL在髂股動脈粥樣硬化斑塊中的高表達可能促進髂股動脈粥樣硬化斑塊的形成，這一發(fā)現(xiàn)可能為髂股動脈粥樣硬化閉塞癥的發(fā)病機制的研究提供幫助，lncRNA ANRIL的檢測有可能成為一個新的診斷髂股動脈粥樣硬化閉塞癥的標志物。