肖衛(wèi)棉，查旭山△，王友發(fā)

濕疹作為一種常見皮膚炎癥反應，可由多種因素引起，典型癥狀在兒童期開始出現，發(fā)病程度輕重不一，容易反復發(fā)作且難于根治，嚴重影響患者生活質量［1-2］。濕疹發(fā)病機制不明，但近年來研究發(fā)現肥大細胞活化參與濕疹發(fā)病過程，并對此的臨床研究越來越多［3-4］。P 物質（substance P，SP）/神經激肽 1受體（neurokinin 1 receptor，NK1R）復合物參與濕疹、慢性蕁麻疹及慢性結腸炎等疾病過程［5-6］，同時也參與調控肥大細胞脫顆粒過程［7］。因此，探究濕疹過程中SP、NK1R 表達及其對肥大細胞活化的影響具有重要臨床意義。丹皮酚是從牡丹皮、芍藥、徐長卿等草本植物中提取的一種生物活性物質［8］。近年來研究發(fā)現，丹皮酚可祛風、除濕、止癢、涼血活血，同時可緩解患者皮膚瘙癢、紅疹及皮膚滲出液中炎性浸潤和細菌感染等癥狀，其抗炎、抗過敏作用在治療濕疹方面具有較好的療效［9-10］，但其作用機制尚不清楚。本研究通過建立濕疹小鼠模型，分析丹皮酚對其皮損組織SP/NK1R 表達及肥大細胞活化的影響，以期為濕疹的臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級C57BL 小鼠120 只，體質量100～120 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產許可證號SCXK（粵）2018-0002，動物質量合格證號為省科委2000A027。所有小鼠于本院動物房中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：自然光照，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。小鼠自由進食、飲水。本研究經動物倫理委員會批準同意，批號為IACUC-01（20160917），實驗符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 丹皮酚（EB03479，25 g/瓶）購自上海士鋒生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（P0768）購自美國Pierce 公司；小鼠SP 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（YS-E1627）購自上海研生生化試劑有限公司；2,4-二硝基氯苯（DNCB，138630-100G）購自美國Sigma-Aldrich 公司；地塞米松（B25793-100 mg）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（ZN1970-IQN）購自北京百奧萊博科技有限公司；類胰蛋白酶（Tryptase）抗體（orb241128）購自英國Biorbyt公司；NK1R抗體（ATA33963）購自武漢益普生物科技有限公司。蛋白電泳儀（型號1659001）、半干轉膜儀（Trans-Blot SD）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠濕疹模型建立及分組給藥 參照文獻［11-13］構建小鼠濕疹模型，具體操作方法為：取100 只小鼠，用5%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠雙耳內側致敏后，以1%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠雙耳內側，每隔4 d致敏1次，共5次后，肉眼觀察小鼠雙耳內側皮膚性狀，若出現紅腫增厚或滲出現象表明模型建立成功。將模型建立成功的小鼠用隨機數字表法分為濕疹模型組，丹皮酚低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組［11］，另設陽性藥物（地塞米松0.65 mg/kg）組，每組20 只。另取20 只小鼠，于小鼠雙耳內側涂抹5%氯化納溶液每次40 μL，后期用1%氯化納溶液40 μL 涂抹，每隔4 d 涂抹1 次，共5 次，作為空白對照（Control）組。丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組均經腹腔注射給予相應劑量藥物0.5 mL，1次/d，共14 d；Control組和濕疹模型組經腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 小鼠耳部濕疹皮損程度評分 各組小鼠末次給藥1 h后，參照文獻［12］進行皮損程度計分：5～6分，雙耳明顯紅腫增厚、角化結痂或滲出；3～4分，紅腫較輕、中度角化者或滲出不明顯；1～2 分，紅腫和滲出均不明顯，或者輕度角化；0 分，正常皮膚。每組小鼠評分取平均值。

1.2.3 小鼠皮損組織HE染色病理學檢測 各組小鼠在做完評分后處死，取雙側耳部組織，剪取0.5 g 置于-80 ℃冰箱中保存，其余組織置于4%多聚甲醛中固定，做石蠟切片。將切片進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，HE 染色6 min，1%鹽酸乙醇分化15 s，蒸餾水漂洗3 min，梯度乙醇脫水3 min，二甲苯透明處理并用中性光學樹脂封片，光鏡下觀察各組耳部病變組織炎癥細胞浸潤情況。

1.2.4 ELISA法檢測SP含量 取小鼠耳部組織，于4 ℃冰箱中解凍后制成10%組織勻漿，離心后，按ELISA 試劑盒說明書檢測SP含量。

1.2.5 免疫組化法檢測耳部組織Tryptase 及NK1R表達 取石蠟切片，進行常規(guī)脫蠟、脫水，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫酶滅活后，加入兔抗鼠一抗抗體（Tryptase、NK1R均為1︰500），于30 ℃孵育過夜，經TBST漂洗3次，加入1︰1 000的羊抗兔二抗溶液，室溫孵育1 h，經TBST漂洗后，加SP 復合物和DAB 顯色劑，蘇木精-伊紅溶液復染，并進行透明、封片。然后于400 倍光鏡下拍照，每片隨機讀取5 個視野，采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)進行半定量測量，結果以5個視野陽性表達的平均光密度值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 以SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較進行單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丹皮酚對小鼠耳部濕疹皮損程度及評分的影響 Control組，濕疹模型組，丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組耳部濕疹皮損評分分別為0分、（5.99±0.10）分、（4.88±0.09）分、（3.02±0.10）分、（2.05±0.09）分、（2.01±0.09）分（n=20，F=7 120.203，P＜0.01）。與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮膚可見紅腫、角化結痂、滲出等損傷，皮損程度評分增加（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組耳部皮膚紅腫、角化結痂、滲出等損傷減輕，皮損程度評分降低（均P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴性；丹皮酚高劑量組與陽性藥物組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 各組小鼠耳組織病理損傷程度觀察 Control組小鼠耳部皮膚組織結構清楚，層次分明，表皮厚度正常；濕疹模型組小鼠表皮角化過度，真皮層可見大量炎癥細胞浸潤；丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組小鼠表皮層角化及真皮層炎癥細胞浸潤明顯改善。見圖2。

2.3 丹皮酚對小鼠皮損組織中SP 含量的影響 與Control組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織SP表達水平明顯升高（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組小鼠耳部皮損組織SP 含量明顯降低（P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴性；丹皮酚高劑量組與陽性藥物組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of SP contents and the expressions of NK1R and Tryptase between six groups表1 各組小鼠SP含量及NK1R、Tryptase表達結果比較（n=20，）

Tab.1 Comparison of SP contents and the expressions of NK1R and Tryptase between six groups表1 各組小鼠SP含量及NK1R、Tryptase表達結果比較（n=20，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與濕疹模型組比較，c與丹皮酚低劑量組比較，d與丹皮酚中劑量組比較，P＜0.05

組別Control組濕疹模型組丹皮酚低劑量組丹皮酚中劑量組丹皮酚高劑量組陽性藥物組F SP（ng/L）100.39±10.93 251.62±11.12a 201.00±12.13ab 174.82±11.16abc 144.55±10.96abcd 140.55±11.14abcd 442.620＊＊NK1R 0.39±0.13 1.62±0.12a 1.00±0.13ab 0.82±0.12abc 0.55±0.14abcd 0.54±0.14abcd 237.784＊＊Tryptase 0.32±0.14 1.86±0.16a 1.25±0.13ab 0.89±0.14abc 0.66±0.15abcd 0.67±0.15abcd 280.477＊＊

2.4 丹皮酚對小鼠皮損組織中NK1R 及Tryptase 表達的影響 與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織NK1R、Tryptase 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組小鼠耳部皮損組織NK1R、Tryptase 表達明顯降低（P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴性；丹皮酚高劑量組與陽性藥物組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1，圖3、4。

3 討論

3.1 各組小鼠模型建立情況及丹皮酚對濕疹模型小鼠的改善作用 濕疹是皮膚科常見炎癥性皮膚疾病，其發(fā)病率高，容易遷移，肥大細胞及炎癥介質變態(tài)反應參與濕疹的發(fā)病過程［14］。李雪松［15］發(fā)現丹皮酚軟膏可治療手部慢性濕疹，且在減輕手部脫屑、皸裂方面的療效優(yōu)于派瑞松。楊正生等［11］發(fā)現腹腔注射丹皮酚可治療小鼠變應性接觸性皮炎，降低其炎癥反應。本研究發(fā)現，與Control 組相比，濕疹模型組小鼠肉眼可見耳部充血、腫脹等損傷，皮損程度評分明顯增高，HE 染色可見耳部皮損組織表皮角化、真皮水腫、炎癥浸潤等病理損傷，提示濕疹模型建立成功。與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽性藥物組小鼠耳部充血、腫脹等損傷減輕，皮損程度評分降低，表皮角化及真皮水腫、炎癥浸潤等病理損傷程度明顯下降，表明丹皮酚可改善濕疹模型小鼠耳部組織紅腫、充血及表皮角化、真皮水腫等炎癥損傷。

3.2 丹皮酚對濕疹模型小鼠耳部組織SP 及NK1R表達的調控作用 SP 是皮膚肥大細胞重要的促分泌素，其過表達可促進肥大細胞脫顆粒，促進炎癥的發(fā)生［16］。NK1R 激活可介導 SP 誘導的肥大細胞募集，增強促炎反應［17］。Tryptase是肥大細胞合成和分泌的特異性中性蛋白酶之一，常被用作肥大細胞活性標志物，其陽性表達可促進肥大細胞脫顆粒釋放活性物質，增強炎癥狀態(tài)下結締組織重塑［18-20］。Choi 等［21］發(fā)現局部使用 SP 可緩解 DNCB 誘導的小鼠特異性皮炎癥狀。Zhan 等［5］發(fā)現SP 可誘導肥大細胞積聚，濕疹患者中SP表達升高，而使用SP阻滯劑和NK1R阻滯劑可有效治療濕疹。李磊磊等［22］發(fā)現Tryptase 在斑禿患者皮損組織中表達增高，且Tryptase 陽性表達的肥大細胞參與斑禿病理過程。本研究發(fā)現，與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R、Tryptase 表達升高，提示濕疹模型小鼠SP、NK1R 表達增高，肥大細胞活性較高；而丹皮酚低、中、高劑量組小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R、Tryptase 表達降低，且丹皮酚各組呈劑量依賴性，表明丹皮酚可抑制濕疹模型小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R 表達，抑制肥大細胞活化，緩解濕疹小鼠皮膚炎性損傷。

綜上所述，丹皮酚可能通過抑制皮損組織中SP、NK1R 表達，抑制肥大細胞活化，緩解濕疹小鼠皮膚炎性損傷癥狀，為臨床治療濕疹提供一定的參考；但本研究也存在一定的不足，本研究未設置SP、NK1R 阻滯劑進行研究，丹皮酚也可能通過其他途徑改善濕疹癥狀，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。

Fig.1 Pictures showing eczema of ear skin of mice in three groups圖1 各組小鼠耳部皮膚濕疹圖

Fig.2 Pathological damage in ear tissue of mice in each group(HE,×200)圖2 各組小鼠耳部組織病理損傷情況（HE，×200）

Fig.3 Immunohistochemical staining of NK1R in ear tissue of mice in six groups(×400)圖3 各組小鼠耳部組織NK1R免疫組化染色結果（×400）

Fig.4 Immunohistochemical staining of Tryptase in the ear tissues of mice in six groups(×400)圖4 各組小鼠耳部組織Tryptase免疫組化染色結果（×400）