李品玉，盛文杰，張嫄怡，楊堅，鄭培麗，張菲菲

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤第5位［1］。腫瘤細胞增殖和凋亡抵抗是導(dǎo)致不良預(yù)后的原因之一，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，AKT）信號通路是經(jīng)典的腫瘤相關(guān)信號通路，對CRC細胞增殖和凋亡發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［2］。因此，針對PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵節(jié)點以及調(diào)控因子進行研究有望為改善CRC患者預(yù)后提供新的突破點。腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1（tumor necrosis factor receptorassociated protein 1，TRAP1）是近年來研究發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)蛋白，在多種腫瘤中異常表達［3］，廣泛參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、增殖、凋亡、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多種生物學(xué)行為。目前TRAP1蛋白與CRC關(guān)系的研究已初見報道［4-5］，但其相關(guān)生物學(xué)功能仍不清楚。本研究旨在探討TRAP1在CRC中的表達和對CRC細胞增殖、凋亡的影響，及其對PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)作用，為針對TRAP1蛋白設(shè)計抗癌藥物提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）標本：選取2018年在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院進行手術(shù)治療的6 例CRC 患者的癌及癌旁配對黏膜組織，所有患者手術(shù)前均未接受過放化療或靶向治療。所有標本在離體后均經(jīng)預(yù)冷的PBS 洗滌干凈，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃保存。（2）細胞及主要試劑：人結(jié)直腸癌細胞株LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480 及正常結(jié)腸永生化上皮細胞NCM460 均由南方醫(yī)科大學(xué)病理實驗室提供。胎牛血清和RPMI-1640 購自美國 GIBCO 公司，TRAP1（兔多抗）、GAPDH（鼠單抗）、CyclinD1（兔多抗）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗購于Proteintech公司，Cleaved-casp3（兔多抗）、casp3（兔多抗）購自Affinity公司，p-PI3K（兔單抗）、PI3K（兔單抗）、p-AKT（兔多抗）、AKT（兔多抗）抗體購自Cell Signaling Technology 公司；LipofectamineTM3000 購自 Life Technologies，CCK8 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，細胞周期及Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析TRAP1 表達 打開Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/），選擇分析類型為Cancervs.Normal Analysis，腫瘤類別（Cancer Type）選擇Colorectal Cancer進行分析，設(shè)置P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的SW480細胞，以1×106個/孔接種于6 孔板中，待細胞密度為30%～50%時采用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染對照序列NC和TRAP1的干擾序列，操作嚴格按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。TRAP1 干擾序列購自蘇州吉瑪公司，si-1 引物：上游5′-CGGUCCCUGUACUCAGAAATT-3′ ，下 游 5′-UUUCUGAGUACAGGGACCGGG-3′；si-2 引物：上游5′-GCUACACCCUGCACUAUAATT-3′，下 游 5′-UUAUAGUGCAGGGUGUAGCGG-3′；si-3 引物：上游 5′-CCTTCCTGGATGCTCTGCATT-3′，下游5′-TGCAGAGCATCCAGGAAGGCC-3′。

1.2.3 Western blot 檢測TRAP1 蛋白對細胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/AKT通路的影響 提取組織和細胞全蛋白，定量后用10%SDS-PAGE 凝膠對蛋白進行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜放入5%牛奶，配搖床緩慢搖動封閉1 h，加入稀釋后的一抗TRAP1（1∶1 000）、CyclinD1（1∶1 000）、Cleaved-Casp3（1∶1 000）、Casp3（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，次日PBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000），配搖床室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯色，并應(yīng)用Image J 軟件分析目標蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值，相對表達量=目標灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.2.4 CCK-8 法檢測TRAP1 對CRC 細胞增殖的影響 將TRAP1的干擾片段及對照片段瞬時轉(zhuǎn)染入SW480細胞，24 h后消化并計數(shù)，以1 000 個/孔的密度接種于96 孔板，分別于24、48、72、96、120 h將孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為含10%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下孵育2 h，全自動酶標儀490 nm 處測定光密度（OD）值，并繪制細胞增殖曲線。每組細胞設(shè)置5個平行復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 平板克隆實驗檢測TRAP1對CRC 細胞克隆形成能力的影響 將干擾TRAP1的SW480細胞及對照細胞計數(shù)后以200 個/孔種植于 6 孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 2 周，甲醇固定15 min，PBS 洗 3 次，吉姆薩染色15 min，水洗后拍照計數(shù)克隆數(shù)目。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測TRAP1對CRC 細胞周期的影響 將干擾TRAP1 的SW480 細胞及對照細胞消化后離心棄上清，預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，預(yù)冷的75%乙醇固定1 h，離心棄上清加入25 μL PI染色液和10 μL RNase A，4 ℃避光反應(yīng)30 min，利用流式細胞儀對各組細胞進行檢測。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測TRAP1對CRC 細胞凋亡的影響 將干擾TRAP1 的SW480 細胞及對照細胞用不含EDTA 的胰酶消化后1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次。隨后用100 μL的 Binding Buffer 重懸細胞，并加入 5 μL AnnexinV-APC 及 5 μL PI 染色液，混勻室溫避光反應(yīng) 15 min，再加入400 μL 的Binding Buffer混勻后上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有實驗均獨立重復(fù)3次，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗。CCK8 結(jié)果采用析因分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAP1 在CRC 組織和細胞中的表達 通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析，在Notterman 數(shù)據(jù)庫中，正常結(jié)直腸組織TRAP1 比結(jié)直腸癌組織中升高（n=18，F(xiàn)old=3.408，P＜0.01）。Skrzypczak 數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)TRAP1 在結(jié)直腸癌組織中的表達比正常腸黏膜組織高（n正常=24，n腫瘤=45，F(xiàn)old=2.014，P＜0.01）。Western blot 顯示，6 對 CRC 組織中 TRAP1 的表達明顯高于癌旁配對正常腸黏膜組織，見表1、圖1A。在結(jié)直腸癌細胞LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480中TRAP1的表達水平（分別為0.81±0.02、1.21±0.04、1.55±0.04、1.89±0.04、2.00±0.03）也明顯高于正常永生化結(jié)腸上皮細胞NCM460（0.45±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=85.297，P＜0.01），見圖1B。

Tab.1 Expression levels of TRAP1 in CRC tissues and their paired paracancerous tissues表1 TRAP1在CRC組織及癌旁正常組織中的表達（n=3，）

Tab.1 Expression levels of TRAP1 in CRC tissues and their paired paracancerous tissues表1 TRAP1在CRC組織及癌旁正常組織中的表達（n=3，）

＊＊P＜0.01

組別正常組織腫瘤組織t標本1 0.43±0.01 0.84±0.02 30.662＊＊標本2 0.73±0.02 1.07±0.05 11.480＊＊標本3 0.72±0.02 1.03±0.06 8.809＊＊組別正常組織腫瘤組織t標本4 0.53±0.02 1.18±0.07 16.790＊＊標本5 0.61±0.02 1.56±0.05 29.306＊＊標本6 0.53±0.02 1.15±0.05 19.853＊＊

Fig.1 The expressions of TRAP1 in CRC tissues and cells圖1 TRAP1在結(jié)直腸癌組織和細胞中的表達

2.2 TRAP1 對CRC 細胞增殖的影響 Western blot結(jié)果顯示，TRAP1 的干擾序列均有效，NC、si-1、si-2、si-3 組干擾效率分別為 1.40±0.03、0.21±0.02、0.36±0.03、0.39±0.03，選取干擾效率最高的si-1組進行后續(xù)研究（n=3，F(xiàn)=1 010.014，P＜0.05），見圖 2。平板克隆實驗顯示，干擾TRAP1的表達（NC、si-1組分 別 為 81.00±3.61、25.67±2.08）可 以 明 顯 降 低SW480 細胞的克隆形成能力（n=3，t=23.020，P＜0.05），見圖3A。CCK8結(jié)果顯示干擾TRAP1的表達可以顯著降低SW480 細胞的增殖能力（n=3，F(xiàn)組間=160.630，F(xiàn)時間=775.226，F(xiàn)交互=16.355，P＜0.05），見圖3B。

Fig.2 The efficiency of TRAP1 siRNAs detected by Western blot assay圖2 TRAP1干擾效率的檢測

Fig.3 The effect of TRAP1 on the proliferation of CRC cells圖3 TRAP1對CRC細胞增殖能力的影響

2.3 TRAP1 對CRC 細胞周期和凋亡的影響 流式細胞檢測結(jié)果顯示，干擾TRAP1 的表達后可以將SW480細胞周期阻滯在G0/G1期（P＜0.01），見表2，圖4A，并且增加細胞凋亡（NC組、si-1組細胞凋亡率分別為 5.80%±0.70%、9.73%±0.68%；n=3，t=6.977，P＜0.01），見圖4B。

Tab.2 The effect of TRAP1 on cell cycles表2 TRAP1對CRC細胞周期的影響 （%，）

Tab.2 The effect of TRAP1 on cell cycles表2 TRAP1對CRC細胞周期的影響 （%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別NC組si-1組t n33 G0/G1期47.75±2.17 59.01±1.14 7.951＊＊S期17.31±0.92 12.41±1.25 5.480＊＊G2/M期34.94±1.27 28.58±1.25 4.413＊

2.4 TRAP1 對增殖、凋亡相關(guān)指標及PI3K/AKT 通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，干擾TRAP1的表達后，細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1 表達降低（P＜0.01），見圖5A，表3；凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Casp3表達增加（P＜0.05），見圖5B，表3；p-PI3K 和p-AKT表達降低（P＜0.01），PI3K/AKT 通路被抑制，見表4，圖6。

3 討論

Fig.4 The effects of TRAP1 on cell cycles and cell apoptosis圖4 TRAP1對CRC細胞周期和凋亡的影響

Fig.5 The effects of TRAP1 on CyclinD1 and Cleaved-caspase 3 protein expressions圖5 TRAP1對CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表達的影響

Tab.3 The effect of TRAP1 on CyclinD1 and Cleavedcaspase 3 protein expressions表3 TRAP1對CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表達的影響 （）

Tab.3 The effect of TRAP1 on CyclinD1 and Cleavedcaspase 3 protein expressions表3 TRAP1對CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表達的影響 （）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別NC組si-1組t n33 CyclinD1 1.33±0.05 0.86±0.05 11.853＊＊Cleaved-Casp3 1.10±0.03 2.07±0.08 18.925＊Casp3 1.28±0.03 1.27±0.03 0.411

CRC 治療是全世界面臨的難題，前期筆者團隊針對CRC 開展了相關(guān)基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）是誘導(dǎo) CRC EMT 和轉(zhuǎn)移的重要因子，而二苯乙烯苷可通過抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)，因此二苯乙烯苷有望通過抑制PI3K/AKT 通路應(yīng)用于CRC 治療［6］。除了腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞的惡性增殖和凋亡抵抗也是介導(dǎo)CRC 患者不良預(yù)后的重要原因。因此探索腫瘤增殖和凋亡相關(guān)基因，有望為治療CRC提供新的方法。

為了進一步尋找CRC 腫瘤相關(guān)基因，本研究通過生物信息學(xué)分析成功篩選出TRAP1 是CRC 潛在的癌基因?；仡櫦韧芯?，TRAP1 在多種腫瘤中高表達。Ou等［7］發(fā)現(xiàn)TRAP1在食管癌中表達升高，與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可通過激活STAT3/MMP2 信號通路，促進食管癌細胞的遷移和侵襲。在甲狀腺癌中，TRAP1 的表達隨著惡性程度增加而增加，通過調(diào)控ERK信號通路促進甲狀腺癌細胞的增殖、抑制凋亡［8］。值得注意的是，TRAP1除了扮演促癌基因角色外，也在部分腫瘤中低表達，從而發(fā)揮抑癌作用。Yin 等［9］研究證實 TRAP1 在膠質(zhì)母細胞瘤中表達降低，并調(diào)控腫瘤細胞侵襲與凋亡。目前TRAP1 在 CRC 中的作用已初見報道，Pak 等［10］研究發(fā)現(xiàn)過表達TRAP1可能導(dǎo)致CRC細胞的局部侵襲，其表達與CRC侵襲深度和不良預(yù)后相關(guān)。Han等［11］通過免疫組化檢測結(jié)直腸癌手術(shù)標本中的TRAP1和切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）的表達，發(fā)現(xiàn)TRAP1 與ERCC1 表達的高低可預(yù)測CRC 對奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶（5-Fu）的化療敏感性。但目前TRAP1 在CRC 中作用的研究大部分處于基因表達水平，缺乏基礎(chǔ)實驗依據(jù)，其在CRC 中的表達和生物學(xué)功能仍需進一步挖掘。

Tab.4 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway of SW480 cells表4 SW480細胞中TRAP1對PI3K/AKT信號通路的影響 （）

Tab.4 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway of SW480 cells表4 SW480細胞中TRAP1對PI3K/AKT信號通路的影響 （）

＊＊P＜0.01

組別NC組si-1組t n33 p-PI3K 1.19±0.02 0.57±0.03 36.454＊＊PI3K 0.18±0.02 0.43±0.02 0.690 p-AKT 1.14±0.01 0.72±0.01 57.277＊＊AKT 0.45±0.01 0.45±0.02 0.702

Fig.6 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway圖6 TRAP1對PI3K/AKT信號通路的影響

本研究多層次檢測了TRAP1 的表達，發(fā)現(xiàn)TRAP1在CRC組織中的蛋白表達水平顯著升高，同樣，與NCM460細胞相比，TRAP1在CRC細胞中的表達也更高。文獻報道TRAP1 可調(diào)控腫瘤細胞增殖和凋亡進程［12-13］。本研究也針對該生物學(xué)行為進行觀察，在SW480 細胞中干擾TRAP1 后，腫瘤細胞的增殖能力和克隆形成能力明顯減弱；流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)干擾TRAP1后SW480細胞周期阻滯在G0/G1期，并且凋亡增加；同時，細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1 表達降低，而凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Casp3表達增加，說明TRAP1 可以促進CRC 細胞增殖、抑制CRC細胞凋亡，是CRC的癌基因。

腫瘤細胞信號傳導(dǎo)與腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［14］，其中，PI3K/AKT 信號通路是與腫瘤增殖和凋亡最相關(guān)的信號通路之一［15］。筆者前期針對PI3K/AKT 的通路及其潛在抑制藥物已經(jīng)開展了相關(guān)基礎(chǔ)研究［6］，另有研究也證實TRAP1抑制劑SNX-2112 可抑制AKT 通路及其下游核因子（NF）-κB 的活性［16］。本研究通過Western blot證實，干擾TRAP1后，CRC 細胞 PI3K 和 AKT 磷酸化水平顯著降低，進而支持TRAP1 可正向調(diào)控PI3K/AKT 信號通路，因此推測其對CRC 細胞增殖和凋亡的影響可能是通過PI3K/AKT信號軸來發(fā)揮的。

綜上，本研究證實TRAP1 是CRC 的癌基因，在CRC 中高表達，可促進CRC 細胞增殖而抑制其凋亡，其潛在機制與TRAP1 激活PI3K/AKT 通路相關(guān)，為針對TRAP1 設(shè)計PI3K/AKT 通路抑制劑和抗腫瘤藥物提供了實驗證據(jù)。