楊瀚林，湯弘婷，楊娟，劉虹麟，李夢醒，李琴山，4△

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，主要表現(xiàn)為腸道侵襲性惡變，是全球范圍內(nèi)第4 高發(fā)的惡性腫瘤，我國每年約有16萬患者死于結(jié)腸癌［1-2］。其常用治療手段為手術(shù)輔以放療或化療，但目前常用化療藥物容易產(chǎn)生耐藥，且藥物對腫瘤細胞的殺傷作用缺乏靶向性。因此，尋找新的結(jié)腸癌化療藥物具有重要臨床意義。甲磺酸阿帕替尼（以下簡稱阿帕替尼）是一類靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factors receptor 2，VEGFR2）的口服小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，已在包括消化系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤及對其他化療藥物產(chǎn)生耐藥的腫瘤中展現(xiàn)出較好療效［3-5］，有臨床應(yīng)用前景。但最近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可通過多種機制對阿帕替尼產(chǎn)生耐藥性，為阿帕替尼的應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)［6-7］。野生型p53基因是一類重要抑癌基因，在60%的結(jié)腸癌中可觀察到p53基因突變，突變型p53促進了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展［8］。然而研究發(fā)現(xiàn)野生型p53基因?qū)δ[瘤發(fā)生、腫瘤細胞獲得干性、腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥有促進作用［9-11］。但野生型p53是否參與了結(jié)腸癌細胞對阿帕替尼產(chǎn)生耐藥，目前報道較少。本研究旨在通過體外實驗觀察敲除結(jié)腸癌細胞HCT116 的野生型p53后，阿帕替尼對HCT116殺傷作用的變化，從而為阿帕替尼治療結(jié)腸癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人結(jié)腸癌HCT116 p53+/+細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心；以CRISPR-Cas9法構(gòu)建的敲除野生型p53的人結(jié)腸癌HCT116 p53-/-細胞株由中日友好醫(yī)院劉虹麟副教授饋贈。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素混合液購自美國sigma 公司。胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司。RIPA 蛋白裂解液、5 倍濃縮的蛋白上樣緩沖液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。PMSF購自北京索萊寶科技有限公司。甲磺酸阿帕替尼片購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。CCK-8 細胞增殖毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液、Annexin V/PI 流式細胞凋亡試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司。鼠抗人 P53 抗體、兔抗人 NF-κB p65 抗體、兔抗人Caspase-3 抗體購自美國CST 公司。鼠抗人GAPDH 抗體購自美國Proteintech 公司。山羊抗兔IgG 二抗抗體、兔抗鼠IgG 二抗抗體均購自美國sigma 公司。0.22 μm PVDF 膜購自美國Merck Millipore 公司。RNA 提取試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒均購自德國Qiagen 公司。Quantinovo Q5 實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher公司。FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司。Western blot電泳儀、ChemiDoc成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶底面積80%～90%時進行傳代。細胞傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，以D-Hanks 洗細胞3 次，0.1%胰蛋白酶消化。隨后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心收集細胞。以新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞傳至2個新的培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的HCT116p53+/+、HCT116 p53-/-細胞，按常規(guī)胰酶消化方法制備細胞懸液，隨后按照5×103細胞/孔將細胞接種于96孔板，接種24 h后加入藥物處理。實驗共設(shè)計4組，阿帕替尼濃度分別為0、15、30、60 μmol/L，并設(shè)置僅有等體積DMEM 完全培養(yǎng)基的空白孔排除培養(yǎng)基干擾。實驗共設(shè)置2個檢測時間點：24 h和48 h，每組設(shè)置3個復孔。藥物處理24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8 試劑，繼續(xù)培育2 h。以酶標儀檢測450 nm 波長下各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率。

1.2.3 Annexin V-APC/PI 法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞，按照2×105細胞/孔將細胞接種于6 孔板，接種24 h 后加入藥物處理。實驗共設(shè)計3組，阿帕替尼濃度分別為0、15、30 μmol/L。藥物處理24 h后收集細胞，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照試劑盒說明書進行Annexin V-APC、PI染色，隨后上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達 以 0、15、30 μmol/L 阿帕替尼處理 HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h，隨后按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA。以微量分光光度計測RNA 濃度，按照試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：65 ℃5 min；25 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min。以微量分光光度計測cDNA 濃度后按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書檢測細胞中p53、NF-κB p65、Caspase-3的mRNA表達水平。實時熒光定量 PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 13 s，進行40 個循環(huán)。引物由美國Invitrogen 公司合成，引物序列見表1。以2-ΔΔCt法計算各組細胞目的基因相對表達水平。

1.2.5 Western blot 檢測 P53、NF-κB p65、Caspase-3 蛋白表達 以 0、15、30 μmol/L 阿帕替尼處理 HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h后提取細胞總蛋白，以BCA法檢測各樣本蛋白濃度，100 ℃加熱10 min蛋白變性后，立即進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF 膜以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，隨后加入 P53（1∶1 000 稀釋）、NF-κB p65（1∶1 000 稀釋）、Caspase-3（1∶1 000 稀釋）、GAPDH（1∶10 000 稀釋）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗4 次，隨后加入HRP 標記的二抗（1∶20 000稀釋），室溫搖床孵育2 h，TBST洗4次。根據(jù)ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒說明書配置發(fā)光液，以Bio-Rad 成像儀進行條帶顯色，以Image J 軟件進行半定量分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 選用SPSS 23.0統(tǒng)計學分析軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，2組間比較用成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCT116 p53-/-細胞的敲除效果 Western blot結(jié)果顯示，HCT116 p53-/-細胞內(nèi)未檢測到P53 蛋白的表達，提示p53基因敲除成功，HCT116 p53-/-細胞可用于后續(xù)實驗，見圖1。

Fig.1 Knockout effect of p53 in HCT116 p53-/-cell圖1 HCT116 p53-/-細胞的p53敲除效果

2.2 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞增殖的影響 CCK-8 結(jié)果顯示，阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞均有增殖抑制作用（P＜0.01），且隨藥物濃度增加，阿帕替尼對2 種細胞的增殖抑制作用均逐漸增強（P＜0.05）。與藥物處理24 h 后相比，阿帕替尼作用48 h 后對2 種細胞的增殖抑制作用增強（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of different concentrations of apatinib on HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cell viability表2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞存活率的影響 （n=3，%，）

Tab.2 Effects of different concentrations of apatinib on HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cell viability表2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞存活率的影響 （n=3，%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 15 μmol/L 組比較，c與30 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組60 μmol/L組F HCT116 p53+/+24 h 100.00±9.93 83.06±1.96a 69.73±2.65ab 41.88±3.60abc 59.048＊＊48 h 100.00±8.29 71.34±2.37a 58.87±4.05ab 29.96±1.84abc 107.607＊＊t-4.944＊6.040＊5.549＊組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組60 μmol/L組F HCT116 p53-/-24 h 100.00±6.20 85.92±2.11a 74.84±4.52ab 55.77±5.27abc 45.915＊＊48 h 100.00±2.87 74.39±1.99a 64.94±4.37ab 42.98±2.70abc 173.013＊＊t-12.801＊6.654＊5.666＊

2.3 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，梯度濃度阿帕替尼處理HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h后，與 0 μmol/L 組相比，15、30 μmol/L 組的細胞凋亡率增高（P＜0.05），且與HCT116 p53+/+細胞相比，相同濃度阿帕替尼處理下，HCT116 p53-/-細胞的凋亡率較低（P＜0.05），見表3、圖2。

Tab.3 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates in HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells表3 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡率的影響 （n=3，%，）

Tab.3 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates in HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells表3 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡率的影響 （n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與0 μmol/L組比較，b與15 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F HCT116 p53+/+29.76±1.57 38.27±1.43a 42.73±3.52a 23.123＊＊HCT116 p53-/-7.23±2.04 16.91±2.60a 22.86±7.18ab 28.011＊＊t -12.071＊＊5.270＊-

2.4 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達水平的影響 實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與0 μmol/L 組相比，梯度濃度阿帕替尼處理24 h 后，HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），且在 HCT116 p53+/+細胞中的表達水平高于HCT116 p53-/-細胞（P＜0.05），見表4。

Fig.2 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates of HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells圖2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-凋亡率的影響

2.5 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的 P53、NF-κB p65、Caspase-3 蛋白表達水平的影響 Western blot 結(jié)果顯示，梯度濃度阿帕替尼處理24 h 后，與 0 μmol/L 組相比，HCT116 p53+/+中 P53、NF-κB p65 蛋白表達水平降低，但 HCT116 p53-/-的NF-κB p65蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖3。阿帕替尼處理后2種細胞的Caspase-3蛋白表達水平均升高，且HCT116 p53+/+的表達水平高于HCT116 p53-/-的表達水平（P＜0.01），見表4、圖3。

Tab.4 The relative expression levels of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 mRNA and protein of three groups表4 各組細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平 （n=3，）

Tab.4 The relative expression levels of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 mRNA and protein of three groups表4 各組細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平 （n=3，）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與0 μmol/L組比較，b與15 μmol/L組比較，P＜0.05

p53 mRNA HCT116 p53-/-組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F HCT116 p53+/+1.00±0.09 1.18±0.05a 1.61±0.06ab 64.772＊＊HCT116 p53-/-0.05±0.00 0.14±0.01a 0.26±0.02ab 202.427＊＊t -30.575＊＊36.473＊＊-P53蛋白HCT116 p53+/+2.16±0.20 0.45±0.05a 0.19±0.03ab 230.220＊＊----組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F NF-κB p65 mRNA HCT116 p53+/+1.00±0.22 1.26±0.03a 1.66±0.14ab 43.791＊＊HCT116 p53-/-0.29±0.02 0.64±0.03a 0.78±0.38ab 212.895＊＊t -16.704＊＊12.007＊＊-NF-κB p65蛋白HCT116 p53+/+2.71±0.09 2.45±0.11a 1.96±0.11ab 41.224＊＊HCT116 p53-/-0.91±0.12 1.73±0.14a 1.84±0.15ab 26.955＊＊組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F Caspase-3 mRNA Caspase-3蛋白t -t -13.038＊＊24.548＊＊-HCT116 p53+/+1.01±0.14 1.29±0.17a 1.71±0.02ab 22.162＊HCT116 p53-/-0.53±0.03 0.68±0.47a 0.76±0.09a 10.099＊5.262＊17.467＊＊-HCT116 p53+/+0.46±0.06 1.83±0.17a 2.86±0.17ab 214.365＊＊HCT116 p53-/-0.10±0.01 0.39±0.03a 0.32±0.01ab 145.148＊＊

Fig.3 Western blot results of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 protein expressions圖3 Western blot檢測p53、NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達水平

3 討論

結(jié)腸癌因發(fā)病較隱蔽、早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時已錯過了最佳治療時機導致治療效果不理想，如何有效治療結(jié)腸癌一直是難題。目前結(jié)腸癌常用化療藥物主要包括5-氟尿嘧啶、卡培他濱、奧沙利鉑等。常規(guī)化療藥物因不良反應(yīng)明顯，缺乏靶向性，還會殺傷正常細胞，故使用受到很多限制。近年來，靶向治療藥物因其特異性與腫瘤細胞位點結(jié)合，對正常細胞殺傷小，成為腫瘤治療的新方向。阿帕替尼是一類靶向VEGFR2的小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，已證實了其在胃癌、肺癌、胰腺癌中的抗癌作用［12-14］，但目前關(guān)于阿帕替尼在結(jié)腸癌中作用的研究較少，其對結(jié)腸癌細胞作用的具體機制尚不明確。除已經(jīng)報道的作用靶點外，阿帕替尼是否通過其他靶點對結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生殺傷作用還需進一步研究探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，與HCT116 p53+/+細胞相比，阿帕替尼處理后HCT116 p53-/-的凋亡率更低。這與Boyer等［11］研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等對敲除野生型p53后結(jié)腸癌細胞HCT116 的抑制作用降低，敲除野生型p53后結(jié)腸癌細胞對藥物產(chǎn)生耐藥。因此，本研究提示野生型p53參與結(jié)腸癌細胞對阿帕替尼產(chǎn)生耐藥的過程。

p53是一類重要抑癌基因，野生型p53可促進受損DNA 修復，抑制腫瘤發(fā)展，但近年來研究顯示野生型p53可以參與腫瘤發(fā)生。Kim等［9］發(fā)現(xiàn)，野生型p53在肝癌中通過促進PUMA基因表達，發(fā)揮促癌作用；在肝癌細胞中，野生型p53可促進腫瘤細胞發(fā)生代謝轉(zhuǎn)換，促進腫瘤發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼處理HCT116p53+/+細胞后，降低了P53 蛋白表達，與Jiang等［15］的研究結(jié)論一致。因此，筆者推斷野生型p53可能在結(jié)腸癌細胞HCT116中發(fā)揮促癌作用，阿帕替尼通過降低野生型p53的表達而發(fā)揮腫瘤殺傷作用。

NF-κB 通路在多種惡性腫瘤中組成性高表達，促進腫瘤細胞增殖、阻止腫瘤細胞凋亡、增加腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移潛力，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。NF-κB 通路經(jīng)典激活途徑為：在腫瘤壞死因子等相關(guān)信號分子刺激下，細胞質(zhì)中NF-κB p65/p50 復合物與 IκB 解離，NF-κB p65/p50 復合物轉(zhuǎn)移至細胞核中，與下游目的基因結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用［17］。腫瘤壞死因子促進NF-κB通路激活需p53參與［18］，NF-κB 通路激活后，可抑制腫瘤細胞發(fā)生凋亡，促進腫瘤發(fā)生［19］。NF-κB 通路可促進結(jié)腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進腫瘤血管生長，對結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展起到正向調(diào)控作用［20］。Caspase-3 處于細胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)的核心位置，是細胞凋亡的執(zhí)行分子，Caspase-3激活后作用于下游分子，誘導細胞發(fā)生凋亡［21］。Capsase-3也可通過促進NF-κB p65降解，抑制NF-κB通路激活［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼可下調(diào)結(jié)腸癌細胞HCT116中p53+/+的P53、NF-κB p65蛋白表達，抑制NF-κB通路激活，并促進Caspase-3蛋白表達，促進細胞凋亡，提示阿帕替尼可能通過抑制p53/NF-κB 通路而促進結(jié)腸癌細胞的凋亡；但敲除結(jié)腸癌細胞P53 表達后，阿帕替尼反而促進了NF-κB p65 蛋白表達。同時，阿帕替尼處理后，與HCT116 p53+/+細胞相比，HCT116 p53-/-細胞的Caspase-3 蛋白表達降低，提示敲除p53 后降低了阿帕替尼對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼處理后，結(jié)腸癌細胞的p53、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達情況不一致，筆者推測可能與mRNA轉(zhuǎn)錄為蛋白的過程中還存在眾多調(diào)控機制的影響有關(guān)，如基因轉(zhuǎn)錄、翻譯過程存在一定延遲［23］，以及不同mRNA 的轉(zhuǎn)錄速率可能存在差異［23］等，mRNA 與蛋白表達水平在某些程度上不一定相符。因此提示，阿帕替尼可能影響p53、NF-κB p65等基因從mRNA 翻譯至蛋白的過程，但具體調(diào)控機制需要進一步研究探討。

綜上，阿帕替尼可能通過p53/NF-κB 通路促進結(jié)腸癌細胞發(fā)生凋亡，敲除野生型P53 后，與HCT116 p53+/+細胞相比，阿帕替尼處理后HCT116 p53-/-細胞的凋亡率較低，提示野生型P53 參與了結(jié)腸癌對阿帕替尼產(chǎn)生耐藥的過程，本研究為阿帕替尼治療結(jié)腸癌的臨床使用提供一定理論基礎(chǔ)。