戴曉玥，吳亮，夏雯，陰晴，鄒治情，周亞玲，何蕾，丁龍坤，席月，張有江，許化溪

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 3. 揚(yáng)州市廣陵區(qū)疾病預(yù)防控中心，江蘇 揚(yáng)州 225001)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)的主要病原菌[1]，患者上呼吸道黏膜表面定植的鮑曼不動(dòng)桿菌是VAP的重要來(lái)源[2]。目前已知的鮑曼不動(dòng)桿菌毒力因子包括外膜蛋白(outer membrane protein, Omp)，磷脂酶D和外膜囊泡等，其中OmpA是外膜蛋白中表達(dá)量最高的一種，參與鮑曼不動(dòng)桿菌外膜囊泡組裝以及細(xì)菌黏附和侵入等過(guò)程[3]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，OmpA也存在于鮑曼不動(dòng)桿菌外膜囊泡中，通過(guò)外膜囊泡攜帶傳遞至遠(yuǎn)處發(fā)揮致病作用，同時(shí)破壞宿主細(xì)胞線(xiàn)粒體完整性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4]或壞死[5]，與鮑曼不動(dòng)桿菌誘發(fā)的VAP嚴(yán)重程度密切相關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌野生株誘導(dǎo)人喉表皮樣癌Hep-2細(xì)胞凋亡能力顯著強(qiáng)于OmpA基因敲除株，且OmpA基因敲除株明顯喪失對(duì)宿主肺泡上皮細(xì)胞的黏附能力[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，將OmpA基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后可誘發(fā)細(xì)胞自噬。攜帶OmpA基因的慢病毒轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞48 h后可引起細(xì)胞含NLR家族Pyrin域NOD樣受體家族3(NLRP3)炎癥小體激活和炎癥因子表達(dá)上調(diào)[8]。此外，OmpA靶向作用于線(xiàn)粒體并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)樹(shù)突狀細(xì)胞凋亡和壞死[6]，但OmpA毒力蛋白的確切致病機(jī)制目前仍不清楚。因此，本研究采用原核表達(dá)技術(shù)制備重組OmpA蛋白[9]，通過(guò)免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，建立鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA毒力蛋白的快速檢測(cè)方法；同時(shí)研究OmpA對(duì)THP-1細(xì)胞自噬與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株 感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pTG19-T購(gòu)自上海捷瑞生物科技公司；pET28a(+)購(gòu)自德國(guó)Novagen公司；鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19606由南京鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科周萬(wàn)青博士惠贈(zèng)；人單核THP-1細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室自行保種和培養(yǎng)。清潔級(jí)雄性新西蘭兔，3只，6周齡，體質(zhì)量2.5～3 kg，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：0001330)，在江蘇大學(xué)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；PCR儀(美國(guó)ABI公司)；LB培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司)；氨芐西林(Amp)、X-gal、卡那霉素和IPTG、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物均購(gòu)自上海捷瑞生物科技公司；2×TaqMaster Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑(SYBR Green染料法)、Annexin V FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和總RNA提取試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊公司；瓊脂糖為西班牙進(jìn)口產(chǎn)品分裝；限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ均為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；引物由蘇州泓迅生物科技公司合成；含鎳的親和樹(shù)脂Ni-NTA(德國(guó)Qiagen公司)；弗氏完全佐劑和不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；免疫印跡系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；β-肌動(dòng)蛋白、Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 B片段(LC3B)抗體均為美國(guó)ABclonal生物科技公司產(chǎn)品；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；基因測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA克隆 復(fù)蘇鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 19606，挑單個(gè)菌落于35 ℃中振搖培養(yǎng)12～16 h(200 r/min)；取200 μL菌液用于細(xì)菌基因組DNA抽提，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA開(kāi)放閱讀框序列(AY485227)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，正向(5′→3′)：ACAGGATCCATGAAATTGAGTCGTATT(BamH Ⅰ)，反向(5′→3′)：ACAAGCTTTTATTGAGCTGCTGCA(Hind Ⅲ)，擴(kuò)增OmpA編碼基因。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，各條引物(25 μmol/L)各0.5 μL，模板2 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并切膠純化后與pTG19-T載體連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH5α；將其涂布于含50 μg/mL Amp、20 μg/mL X-gal和10 μg/mL IPTG的LB瓊脂平板，于37 ℃中培養(yǎng)12 h；藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，并挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR法驗(yàn)證后送上海生工生物工程公司測(cè)序分析。

1.2.2 OmpA/pET-28a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤的OmpA/pTG19-T質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，切膠回收OmpA目的片段和pET-28a載體大片段，在T4連接酶作用下16 ℃過(guò)夜連接；次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH5α，挑取菌株經(jīng)搖菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，繼續(xù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coilBL21，用于后續(xù)重組OmpA表達(dá)純化。

1.2.3 重組OmpA蛋白表達(dá)純化 轉(zhuǎn)化后的BL21菌株接種于含硫酸卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，于37 ℃中200 r/min孵育12 h；次日取新鮮飽和菌液按1 ∶100比例接種新LB培養(yǎng)液并繼續(xù)增菌至D(600 nm)=0.6；分別加入終濃度為1 mmol/L或0.4 mmol/L IPTG，并分別在25 ℃和30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為2、4、6、8 h；然后行8 000 r/min離心，收集菌體并重懸于200 μL雙蒸水中，經(jīng)超聲裂解后取上清液行SDS-PAGE，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)重組OmpA表達(dá)量。在最佳誘導(dǎo)劑濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間下大量增菌，離心收集細(xì)菌并重懸于結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH=8.0)，冰上超聲裂解菌體；以16 000 r/min離心20 min；收集上清液并與Ni-NTA介質(zhì)充分結(jié)合，用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=8.0)沖洗Ni-NTA親和層析柱至穿流液D(280 nm)<0.01；最后以洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH=8.0)洗脫結(jié)合蛋白，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后以考馬斯亮藍(lán)染色觀察純化結(jié)果。

1.2.4 OmpA多克隆抗體制備及抗體水平檢測(cè)

1.2.4.1 OmpA多克隆抗體制備 純化的重組OmpA蛋白與等量弗氏完全佐劑充分乳化，以背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射法免疫新西蘭兔，免疫量為1 mg/只。每次免疫前采兔耳緣靜脈血用于效價(jià)測(cè)定，首次免疫后分別于第3周和第5周行再次免疫以提高抗體效價(jià)，第2次和第3次免疫均使用弗氏不完全佐劑。采用ELISA法檢測(cè)兔血清中抗OmpA-IgG血清滴度，以羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000)為二抗，酶標(biāo)儀檢測(cè)D(450 nm)。當(dāng)抗體效價(jià)大于1 ∶320 000時(shí)，經(jīng)心臟采血并分離血清用于續(xù)研究。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)臨床菌株OmpA表達(dá) 以自制兔多抗檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19606和6株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌。以兔血清為一抗，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床菌株OmpA表達(dá)。血平板上刮取1個(gè)菌落并與20 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min；經(jīng)12 000 r/min離心2 min；取上清液行SDS-PAGE。80 V 120 min；350 mA 90 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；自制抗血清(1 ∶4 000稀釋)于4 ℃振搖過(guò)夜；TBST洗滌3次，每次15 min；加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000)孵育1 h；TBST洗滌3次；用ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯影，照相記錄結(jié)果。

1.2.4.3 鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者血清中OmpA抗體水平檢測(cè) 取適量重組OmpA蛋白與上樣緩沖液充分混勻，煮沸，行SDS-PAGE。選擇4例行機(jī)械通氣的VAP患者，根據(jù)患者臨床癥狀和微生物培養(yǎng)結(jié)果確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌感染。以患者血清為一抗，羊抗人IgG-HRP為二抗，采用蛋白質(zhì)印跡法，檢測(cè)患者插管前和VAP發(fā)生時(shí)(間隔時(shí)間大于14 d)血清中OmpA抗體(IgG型)水平，方法同“1.2.4.2”。

1.2.5 重組OmpA對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥、自噬及凋亡作用的影響

1.2.5.1 THP-1細(xì)胞與重組OmpA共孵育及分組

THP-1細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2環(huán)境中穩(wěn)定傳代至第6代用于本研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜；次日加入終濃度為100 μg/mL的佛波酯誘導(dǎo)成貼壁巨噬細(xì)胞狀態(tài)；待細(xì)胞完全貼壁后分別加入終濃度為1 μg/mL和10 μg/mL的重組OmpA蛋白，同時(shí)設(shè)未加重組蛋白為陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)1 h、3 h和6 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢驗(yàn)。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC-3和Beclin-1表達(dá) 棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL RIPA裂解液于冰上裂解15 min；12 000 r/min離心10 min；收集上清液用于蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，方法同“1.2.4.2”。一抗LC-3抗體、Beclin-1抗體、β-肌動(dòng)蛋白抗體均1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；二抗羊抗兔IgG-HRP 1 ∶1 000稀釋?zhuān)谑覝胤跤? h；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及活性氧產(chǎn)生水平 采用Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡，DCFH-DA探針?lè)z測(cè)THP-1細(xì)胞活性氧產(chǎn)生，操作方法嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5.4 qRT-PCR法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1和IL-1β等mRNA表達(dá)NLRP3、Caspase-1、IL-1β和GAPDH等mRNA引物序列見(jiàn)表1。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA鏈。qRT-PCR法反應(yīng)總體系20 μL，包括SYBR Green Master混合物10 μL，上下游引物各(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，反應(yīng)共計(jì)40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中樣本mRNA的Ct值通過(guò)GAPDH的Ct值均一化，即ΔCt=Ct樣本-Ct內(nèi)參，樣本基因mRNA相對(duì)豐度值以2-ΔΔCt值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 OmpA編碼基因的擴(kuò)增

以ATCC 17606菌株DNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 071 bp，與預(yù)期大小一致。

2.2 OmpA/pET-28a載體酶切鑒定

OmpA/pET-28a載體經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，載體的插入片段長(zhǎng)度與目的基因片段大小一致?；驕y(cè)序結(jié)果表明，插入片段基因序列與鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因(AY485227)序列一致，OmpA/pET-28a載體構(gòu)建成功。

2.3 重組OmpA表達(dá)純化

在不同的時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)濃度下，電泳結(jié)果顯示，菌株在30 ℃和0.4 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)8 h可獲得最大重組OmpA蛋白產(chǎn)量。經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化后，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE可見(jiàn)38 000處有一條清晰條帶，即為重組OmpA蛋白(圖1)。BCA法測(cè)定濃度為3.25 mg/mL，SDS-PAGE結(jié)果表明重組OmpA蛋白分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值相符。

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)參照物；A：1，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌；2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌；B：1，穿流液；2，洗脫液

2.4 臨床菌株OmpA蛋白表達(dá)

各株菌中均可檢出OmpA表達(dá)，而大腸埃希菌BL21株中無(wú)反應(yīng)，表明自制多抗可以識(shí)別臨床菌株OmpA蛋白。見(jiàn)圖2。

1：大腸埃希菌BL21；2：鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606；3～8：6株臨床菌株

2.5 患者血清中OmpA抗體表達(dá)

結(jié)果表明，4位VAP患者氣管插管前后血清中均可以檢出IgG型OmpA抗體，且VAP發(fā)生時(shí)患者血清中OmpA抗體水平顯著高于氣管插管前(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.6 OmpA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞自噬

1，3，6 h時(shí)，10 μg/mL組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，并且LC3-Ⅱ在6 h和Beclin-1在1、3 h相對(duì)表達(dá)量顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)。由此可見(jiàn)，隨著重組OmpA蛋白作用時(shí)間延長(zhǎng)，10 μg/mL組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)量逐漸升高，呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)圖4。

1～4：患者編號(hào)；a：P<0.05，與插管前比較

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與同時(shí)間1 μg/mL組比較

2.7 重組OmpA蛋白誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡發(fā)生

1，3，6 h時(shí)，10 μg/mL組THP-1細(xì)胞凋亡率顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)和對(duì)照組(P均<0.05)，而1，3 h時(shí)，1 μg/mL組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。作用6 h時(shí)，1 μg/mL組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，重組OmpA蛋白10 μg/mL作用THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)圖5。

2.8 重組OmpA蛋白誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化

1 h時(shí)，1 μg/mL和10 μg/mL組IL-1βmRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P均<0.01)。3 h時(shí)，10 μg/mL組NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達(dá)量顯著高于1 μg/mL組(P均<0.05)和對(duì)照組(P均<0.01)，而1 μg/mL組和對(duì)照組間二者表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 h時(shí)1 μg/mL和10 μg/mL組IL-1βmRNA表達(dá)量與自身對(duì)應(yīng)1 h相比，明顯降低(t=5.24, 10.92,P均<0.05)。6 h時(shí)，10 μg/mL組NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達(dá)量較3 h時(shí)顯著降低(t=5.59,10.79,P均<0.05)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而1 μg/mL組THP-1細(xì)胞NLRP3mRNA和Caspase-1mRNA表達(dá)量顯著高于10 μg/mL組(t=8.91, 7.03,P均<0.05)和對(duì)照組(t=10.00, 8.00,P均<0.05)。見(jiàn)圖6。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與同時(shí)間1 μg/mL組比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與同時(shí)間1 μg/mL組比較

2.9 重組OmpA蛋白誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞活性氧生成

1 h時(shí)，1 μg/mL組和10 μg/mL組活性氧含量均明顯高于對(duì)照組(t=16.33,t=15.57,P均<0.01)，且10 μg/mL組明顯高于1 μg/mL組(t=4.39,P= 0.048)；10 μg/mL組作用3 h時(shí)活性氧含量較1 h時(shí)明顯下降(t=11.68,P= 0.007)，6 h活性氧含量較3 h時(shí)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖7。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與同時(shí)間1 μg/mL組比較

3 討論

Beclin-1(酵母ATG6同源物)是重要的自噬調(diào)控蛋白；此外，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)胞質(zhì)中LC3-Ⅰ經(jīng)加工轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ并定位于自噬體膜。因此通過(guò)檢測(cè)兩種LC3蛋白表達(dá)量的比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和Beclin-1蛋白表達(dá)量可評(píng)估細(xì)胞自噬發(fā)生[9-10]。Jin等[11]通過(guò)敲除鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因構(gòu)建外膜囊泡不含OmpA的缺陷菌株，并發(fā)現(xiàn)該缺陷株誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬和死亡能力較野生株明顯減弱。本研究結(jié)果表明，鮑曼不動(dòng)桿菌重組OmpA蛋白可以體外誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞自噬和凋亡，且隨重組蛋白濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。由此推測(cè)，在感染早期，大量宿主免疫細(xì)胞的自噬和凋亡有助于控制感染擴(kuò)散，并加速機(jī)體對(duì)病原體的清除。

免疫細(xì)胞釋放的炎癥因子是固有免疫的重要組成部分，而由NLRP3、Caspase-1和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白組成的NLRP3炎癥小體的激活是啟動(dòng)免疫防御的關(guān)鍵[12]，但NLRP3的過(guò)度激活又會(huì)導(dǎo)致宿主正常組織損傷[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌可以激活宿主巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化[14]。本研究中則進(jìn)一步證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌的重要毒力蛋白OmpA可以導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化和活性氧產(chǎn)生，且該能力似乎隨著OmpA蛋白作用濃度升高而增強(qiáng)，在作用后期均下降。由此推測(cè)，在鮑曼不動(dòng)桿菌感染初期，細(xì)菌OmpA刺激宿主巨噬細(xì)胞，激活NLRP3炎癥小體并產(chǎn)生大量活性氧發(fā)揮殺傷病原體效果；隨著感染持續(xù)活性氧等炎癥因子會(huì)誘發(fā)巨噬細(xì)胞自噬發(fā)生以抑制炎癥小體的激活，防止機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)以避免正常細(xì)胞和組織損傷。

機(jī)體可通過(guò)適度自噬下調(diào)炎癥水平，其機(jī)制可能是通過(guò)清除受損的線(xiàn)粒體從而減少活性氧及線(xiàn)粒體DNA釋放，以抑制炎癥小體的活化，并且凋亡相關(guān)蛋白BCL家族成員能抑制NLRP1自身寡聚化，繼而抑制Caspase-1活化及IL-1β成熟[15]。本研究結(jié)果顯示，在高濃度OmpA或長(zhǎng)時(shí)間作用下，THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活被細(xì)胞自噬所抑制，其結(jié)果可能會(huì)阻礙病原體的識(shí)別和清除，有利于病原體持續(xù)在宿主體內(nèi)存活和增殖，并引起嚴(yán)重感染癥狀。而自噬對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制存在兩面性，適度的自噬水平可以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，防止重要器官因過(guò)度炎癥反應(yīng)而損傷[16]。

綜上所述，OmpA是鮑曼不動(dòng)桿菌的重要毒力蛋白，可以誘發(fā)宿主巨噬細(xì)胞自噬、凋亡，并可以激活NLRP3炎癥小體?；颊唧w內(nèi)自噬水平和炎癥水平與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)患者體內(nèi)自噬水平可以降低感染后炎癥損傷。