薛菲，余孟珠，單文琪，盧紅艷，汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 兒科; 2. 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病。目前公認(rèn)的機(jī)制是由于輔助性T細(xì)胞(help T cell，Th)失衡所導(dǎo)致的，其中Th1降低、Th2增高而引起Th1/Th2失衡，Th2可激活B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白 E(immunoglobulin E，IgE)并介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等誘發(fā)Ⅱ型超敏反應(yīng)和氣道炎癥。此外，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)失衡在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。由于哮喘機(jī)制復(fù)雜，目前尚不清楚Th17/Treg失衡是如何參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是由不成熟的髓系細(xì)胞組成的異質(zhì)性細(xì)胞群[2]。MDSCs在小鼠中可被分為兩個亞群，分別為粒細(xì)胞型MDSCs(granulocytic MDSCs，G-MDSCs)，表型為CD11b+Ly6G+Ly6Clow及單核細(xì)胞型MDSCs (monocytic MDSCs，M-MDSCs)，其表型為CD11b+Ly6G-Ly6Chigh[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒外周血中的MDSCs與Th17呈正相關(guān)[4]。本研究分析Th17、Treg及MDSCs細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠脾細(xì)胞中水平的變化及肺組織中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，從而初步探索其在哮喘發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

6～8周齡SPF級雄性BALB/c小鼠(18～20 g)購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXK(蘇)2017- 0007，在江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級飼養(yǎng)。Ⅱ級和Ⅴ級卵清蛋白(ovalbumin，OVA)均為美國Sigma公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgE、免疫組化IL-17抗體(英國Abcam公司)；抗山羊第二抗體和PMA/Ionomycin及BFA/Monensin購于中國聯(lián)科生物；流式抗體FITC-CD11b、APC-Ly6G、PE-Ly6C、PE-IL-17、免疫組化骨髓分化抗原(Gr-1)抗體(美國BioLegend公司)；FITC-CD4、免疫組化叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)抗體，破膜固定液(美國eBioscience公司)；小鼠Treg試劑盒(美國Thermo公司)。

1.2 哮喘小鼠模型建立

將小鼠隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液(PBS)組和模型組，每組6只。在1、8、15天，PBS組腹腔注射PBS，同時(shí)模型組腹腔注射100 μgⅤ級卵清蛋白和10%氫氧化鋁凝膠(自配)懸液，第22～28天每天霧化吸入2%Ⅱ級卵清蛋白溶液，每次1 h。最后一次霧化24 h后取眼球血，然后處死小鼠。

1.3 ELISA法檢測血清OVA特異性IgE

小鼠采血后，4 000 r/min離心25 min收集上清液，包被4℃過夜，用5%牛奶封閉，加樣，孵山羊抗小鼠IgE抗體(1 ∶250)，37℃溫育2 h，TBST洗板5次，再孵抗山羊二抗(1 ∶5 000)，37℃溫育1 h，TBST洗板5次，加入TMB顯色液，37℃溫育20 min，加入終止液50 μL，顯色終止后，在450 nm波長檢測光密度(D)值。

1.4 HE染色及PAS染色檢測肺組織病理變化

將左肺在10%的甲醛溶液中固定，然后用石蠟包埋，將包被組織切4 μm厚做HE染色及PAS染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織氣道變化。HE染色步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水后，分別用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟2遍，每遍15 min；用等比例二甲苯和無水乙醇浸泡2 min后用無水乙醇清洗2遍，每遍5 min；使用80%乙醇脫水5 min再用蒸餾水洗5 min；用蘇木素液染色5 min后流水沖洗5 min；用1%鹽酸乙醇沖洗30 s后，再置入1%的伊紅染液中浸泡30 s，隨后再次清洗；切片分別置于 95%、95%、100%、100%的乙醇中脫水，各1 min，后放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中透明，各3 min；最后用中性樹脂封片。PAS染色步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水后滴加高碘酸溶液染色15 min，浸入大量自來水中沖洗5 min；浸入蒸餾水洗2次，擦干切片上的多余水分；滴加Schiff氏液10 min，流水沖洗5 min，滴加蘇木素染液3 min，流水沖洗5 min；常規(guī)脫水、透明、用中性樹脂封片。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中Th17、Treg、MDSCs細(xì)胞的比例

脾臟研磨去除紅細(xì)胞后，取1×106細(xì)胞做流式細(xì)胞術(shù)。MDSC標(biāo)記抗-CD11b、抗-Ly-6G、抗-Ly-6C；Treg細(xì)胞按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色；Th17在使用PMA/Ionomycin和BFA/Monensin激發(fā)5 h后，加入抗-CD4孵育30 min后使用破膜固定液破膜30 min，再使用抗IL-17孵育30 min后用PBS洗去未結(jié)合抗體，用4%的多聚甲醛固定，然后使用流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)進(jìn)行細(xì)胞檢測并用Flowjo v10.0.7軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測肺組織Gr-1、IL-17和Foxp3的表達(dá)

將石蠟切片脫蠟至水，使用枸櫞酸熱修復(fù)，冷卻至室溫，用PBS洗3次，加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，用PBS洗3次，加抗Gr-1、IL-17、Foxp3抗體，4℃過夜，PBS洗3次，滴加快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔二抗，室溫孵育20 min，PBS洗3次。滴加DAB溶液(需現(xiàn)配現(xiàn)用)，顯微鏡下觀察3～4 min后自來水沖洗，使用蘇木素復(fù)染，PBS反藍(lán)。常規(guī)脫水、透明、用中性樹脂封片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察兩組小鼠肺組織的浸潤情況，其中淺黃色為弱陽性細(xì)胞，棕黃色為陽性細(xì)胞，并用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型成功建立

HE染色結(jié)果顯示，與PBS組相比，模型組小鼠氣道周圍可見大量炎性細(xì)胞明顯浸潤，氣管壁增厚，管腔不規(guī)則；在PAS染色中，模型組小鼠肺組織杯狀細(xì)胞及黏液分泌明顯增多。同時(shí)模型組小鼠血清中IgE含量顯著升高(t=11.08，P<0.001)。見圖1。結(jié)果表明成功建立了小鼠哮喘模型。

圖1 小鼠肺組織HE、PAS染色(×400)及血清IgE水平

2.2 哮喘小鼠脾細(xì)胞中Th17比例增加而Treg細(xì)胞比例減少

用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-17+Th17細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞結(jié)果顯示，哮喘模型小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例較PBS組顯著增加(t=5.685，P<0.01)，Treg細(xì)胞的比例顯著下降(t=5.596，P<0.01)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾細(xì)胞中Th17及Treg細(xì)胞比例

2.3 哮喘小鼠脾細(xì)胞中的G-MDSCs比例增加

流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾細(xì)胞中的MDSCs的兩個亞群結(jié)果顯示，與PBS組相比，哮喘模型組小鼠脾細(xì)胞中CD11b+Ly6G-Ly6Chigh的M-MDSCs比例無顯著差異(t=0.691 6，P>0.05)，但CD11b+Ly6G+Ly6Clow的G-MDSCs顯著增高(t=4.404，P<0.01)。見圖3。

圖3 小鼠脾細(xì)胞中M-MDSCs及G-MDSCs比例

2.4 哮喘小鼠肺組織中Gr-1、IL-17表達(dá)上調(diào)而Foxp3表達(dá)下調(diào)

免疫組化染色結(jié)果顯示，Gr-1定位于氣道上皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，IL-17主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)oxp3主要定位于細(xì)胞質(zhì)。如圖4所示，半定量分析結(jié)果顯示模型組小鼠肺中Gr-1(t=4.552，P<0.01)和IL-17(t=3.76，P<0.01)表達(dá)明顯上調(diào)，而Foxp3表達(dá)明顯下調(diào)(t=3.508，P<0.01)。

圖4 小鼠肺組織Gr-1、IL-17及 Foxp3的表達(dá)(免疫組化×400)

3 討論

在過去的幾十年里，中國兒童的哮喘患病率有所上升[5]，但迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究通過建立哮喘小鼠模型，探討 Th17、Treg、MDSCs細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用。結(jié)果表明，哮喘小鼠血清IgE水平升高，HE染色及PAS染色均能發(fā)現(xiàn)模型組的氣道炎性細(xì)胞浸潤明顯，氣管壁增厚，管腔不規(guī)則，黏液分泌增加。這表明本實(shí)驗(yàn)中哮喘小鼠模型成功建立。

近些年來，Th17/Treg細(xì)胞平衡與哮喘的關(guān)系引起研究者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)在一些哮喘小鼠模型和其他疾病的模型中[6]，Th17/Treg細(xì)胞是失衡的，Th17細(xì)胞的高表達(dá)主要表現(xiàn)是其分泌的細(xì)胞因子IL-17高表達(dá)[7]，而Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)降低。Treg細(xì)胞是目前已知的具有免疫抑制作用的免疫細(xì)胞，在免疫耐受上具有重要作用。而Th17/Treg平衡對維持機(jī)體穩(wěn)定具有一定的調(diào)節(jié)作用[8]。

與上述研究結(jié)果相一致，本研究中哮喘小鼠脾細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比例增加，而Treg細(xì)胞比例降低。目前MDSCs細(xì)胞是研究腫瘤免疫的熱點(diǎn)，MDSCs能調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)[9]。而在一些自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，MDSCs與T細(xì)胞關(guān)系密切。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的多發(fā)硬化的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，脾源性MDSCs雖然會抑制T細(xì)胞功能，但同時(shí)可以促進(jìn)Th17的分化、增殖[10]。Wu等[11]發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的MDSCs與Th17水平及病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；而且系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的MDSCs在體外能促進(jìn)Th17的分化。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周循環(huán)和淋巴組織中MDSCs數(shù)量增加，且與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)，關(guān)節(jié)炎小鼠和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)分離的MDSCs均可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[12]。張艷麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者外周血中的MDSCs明顯高于肺炎患者和健康者。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒體內(nèi)MDSCs與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)，哮喘小鼠中G-MDSCs、Arg1mRNA的表達(dá)增加[14]。本研究也證實(shí)哮喘小鼠脾細(xì)胞中G-MDSCs比例增加。但是否哮喘小鼠中高表達(dá)的G-MDSCs細(xì)胞可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，尚需要進(jìn)一步研究。

因?yàn)橄∈蟮难装Y部位是肺臟，我們進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化染色檢測了小鼠肺組織中Gr-1、IL-17和Foxp3蛋白的表達(dá)。其中Gr-1也被稱為Ly6G/Ly6C，是G-MDSCs的標(biāo)志[15]；IL-17是Th17細(xì)胞的主要細(xì)胞因子；Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示與Th17、Treg、G-MDSCs細(xì)胞在脾細(xì)胞中比例趨勢一致，哮喘小鼠肺組織中高表達(dá)Gr-1、IL-17，低表達(dá)Foxp3，提示哮喘小鼠的脾細(xì)胞及局部炎癥部位Th17、G-MDSCs細(xì)胞增加，同時(shí) Treg細(xì)胞減少。

綜上所述，哮喘小鼠脾細(xì)胞及肺組織中G-MDSCs、Th17細(xì)胞比例增加，Treg細(xì)胞減少，三者可能共同參與哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。