張睿，孫繼芾，陳謙，曹蘇成，黃永輝

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱一科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCIRI) 是指臨床上由于脊柱骨折、胸腹主動脈瘤壓迫等情況下，脊髓在特定時間段進(jìn)入相對缺血的狀態(tài)，醫(yī)生通過手術(shù)解除壓迫后，脊髓組織得以恢復(fù)灌注，但是其功能并沒有恢復(fù)，反而在之前的功能障礙上逐漸加重，出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能損害，甚至導(dǎo)致肢體癱瘓等嚴(yán)重后果[1-2]。脊髓神經(jīng)細(xì)胞對缺氧缺血的反應(yīng)相當(dāng)敏感，短時間內(nèi)即可引起明顯的脊髓損傷，目前臨床上仍沒有有效的預(yù)防措施[3]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，缺血后處理(ischemic post-conditioning,IPC)對SCIRI具有保護(hù)效果[4],然而其保護(hù)機(jī)制尚無定論。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在機(jī)體多個組織器官廣泛表達(dá)，參與維持胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)[5]。發(fā)生SCIRI過程中，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而CaSR在其調(diào)節(jié)中舉足輕重[6]。研究證實(shí)CaSR在大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)廣泛表達(dá)，并且在缺血再灌注損傷時表達(dá)增加[7]。同時Caspase-12是鈣超載誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡這條信號通路中的特異性蛋白[8]，因此Caspase-12表達(dá)變化能間接反映CaSR變化。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠SCIRI模型，觀察IPC對SCIRI的保護(hù)作用及IPC后脊髓組織中CaSR和Caspase-12表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

清潔級SD大鼠50只，雌性，體重220～250 g，由江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：NO.201905966，許可證號：SCXK(蘇)2018- 0012。β-肌動蛋白抗體、CaSR抗體(兔抗鼠)及Caspase-12抗體(美國CST公司)；羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；GdCl3(美國Sigma公司)；NPS2390(美國Tocris公司)；EnVision免疫組化試劑盒(丹麥Dako公司)；TUNEL檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2 動物分組

采用SRS抽樣法將50只SD大鼠平均分為5組：假手術(shù)組，缺血再灌注模型組(IR組)，IR模型+IPC組(IPC組)，IR模型+IPC+激動劑組(IPC-GdCl3組)和IR模型+抑制劑組(NPS2390組)。

1.3 建立SCIRI模型

IPC-GdCl3組和NPS2390組，提前2天經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射CaSR激動劑GdCl3或CaSR抑制劑NPS2390，劑量分別為30 μmol/kg、10 μmol/kg，注射2天。術(shù)前充分禁食禁水。假手術(shù)組大鼠予腹腔麻醉(7%水合氯醛)，手術(shù)開腹游離腹主動脈，不進(jìn)行其他處理，暫不完全縫合切口，待30 min左右關(guān)腹。其余各組大鼠麻醉后均采用改良Zivin法建立SCIRI模型[9-10]：腹腔注射麻醉，待麻藥起效后(約數(shù)分鐘)予腹部備皮，將大鼠牢靠固定于手術(shù)臺，予皮膚消毒并鋪巾；取腹正中線切開約3 cm切口，輕輕掀開大網(wǎng)膜及腸管，鈍性分離軟組織，顯露腹主動脈，沿其主干找到腸系膜前動脈及右腎動脈，游離之間的腹主動脈段，使用清潔的金屬動脈夾將其夾閉。為保護(hù)大鼠胃腸道等其他內(nèi)臟器官，先用生理鹽水沖洗局部腹腔，將外翻的大網(wǎng)膜、腸管理順后小心納入切口，切口暫不完全縫合，將動脈夾柄部留于腹腔以外，周圍填蓋清潔溫水打濕的棉球以保暖。25 min后，小心取出動脈夾，恢復(fù)血流灌注，予腹腔滴注適量青霉素預(yù)防感染，縫合切口，碘伏消毒。IPC組和IPC-GdCl3組在恢復(fù)灌注3 min后再次夾上動脈夾3 min，然后松開動脈夾2 min后再次夾閉2 min，最后夾閉1 min后徹底取出動脈夾，縫合。再灌注24 h后(SCIRI后24 h為CaSR受體表達(dá)高峰[11])開始BBB(Basso Beattie Bresnahan locomotor rating scale)評分及提取脊髓組織。

1.4 BBB評分

各組大鼠再灌注24 h后分別予BBB評分，判斷大鼠脊髓損傷情況。總共21個分級[12]，無可見后肢運(yùn)動為0分；持續(xù)的掌面移動和協(xié)調(diào)步態(tài)，足趾保持抓地，主動爪始終平行于穩(wěn)定的軀干，尾巴持續(xù)翹起為21分。評分完成后，每組取9只平均分別用于蛋白質(zhì)印跡、免疫組化以及TUNEL法檢測。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12的表達(dá)

處死大鼠，取L2～L4節(jié)段脊髓，采用裂解法提取蛋白，并測定蛋白濃度。配置分離膠、濃縮膠，連夾板放入電泳裝置，加電泳液，點(diǎn)樣孔內(nèi)加蛋白定量標(biāo)志物4 μL，其余每孔加樣本15～20 μL；電泳電壓70 V，當(dāng)?shù)鞍子局练蛛x膠、濃縮膠分界線時，將電壓調(diào)至120 V，待蛋白泳至凝膠底部時關(guān)閉電源；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂牛奶封閉；加一抗(CaSR 1 ∶500；Caspase-12 1 ∶500；β-肌動蛋白1 ∶1 000)，4 ℃慢搖過夜；TBST洗脫，加二抗(1 ∶5 000)，常溫慢搖1 h并洗脫；曝光顯影，測定灰度值并定量分析。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12的表達(dá)

各組大鼠麻醉，打開腹腔，心尖部插入細(xì)管，先用PBS灌洗，然后4%低聚甲醛固定，分離取出L2～L4節(jié)段脊髓組織，甲醛浸泡12 h后用PBS充分洗凈；適當(dāng)修剪組織，予脫水、二甲苯透明，而后制備石蠟切片。使用試劑盒分別進(jìn)行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟，PBS沖洗；3%H2O2孵育10 min；沖洗后稀釋山羊血清封閉10 min；倒去血清滴加一抗CaSR(1 ∶400)和Caspase-12(1 ∶400)室溫孵育2 h；PBS沖洗后，二抗工作液顯色劑復(fù)合物孵育30 min，再水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。鏡下觀察陽性表達(dá)，CaSR陽性呈棕色或褐色，Caspase-12陽性呈藍(lán)色。

1.7 TUNEL法檢測大鼠脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡

大鼠處理及制備石蠟切片同免疫組化，各組操作均按照TUNEL熒光染色試劑盒說明書(羅氏)。熒光顯微鏡下觀察脊髓組織，細(xì)胞核呈綠色即為TUNEL染色陽性細(xì)胞，各組予陽性細(xì)胞計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠再灌注后24 h BBB評分比較

假手術(shù)組、IR組、IPC組、IPC-GdCl3組和NPS2390組大鼠BBB評分分別為20.80±0.422、9.30±0.949、15.20±0.919、9.00±0.667、14.40±0.843，總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=384.173，P<0.01)；其中，各建模組BBB評分均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，說明建模后大鼠后肢運(yùn)動功能明顯損傷，建模有效；IPC組、NPS2390組BBB評分均明顯高于IR組(P<0.05)，說明IPC、抑制劑NPS2390預(yù)處理這兩種干預(yù)方法均能使大鼠后肢運(yùn)動功能損傷減輕，IPC與NPS2390均具有相似的保護(hù)作用；IPC組BBB評分明顯高于IPC-GdCl3組(P<0.05)，說明經(jīng)激動劑GdCl3預(yù)處理的大鼠IPC治療效果較差。

2.2 各組大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12蛋白表達(dá)比較

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，各模型組CaSR和Caspase-12表達(dá)明顯高于假手術(shù)組；IPC組較IR組CaSR及Caspase-12表達(dá)量明顯降低，且NPS2390組較IR組CaSR及Caspase-12表達(dá)量也明顯降低；IPC-GdCl3組較IPC組CaSR和Caspase-12表達(dá)量明顯增加。說明IPC抑制了CaSR和Caspase-12的表達(dá)。見圖1。

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與IR組比較；c：P<0.05,與IPC組比較

2.3 各組大鼠脊髓組織CaSR和Caspase-12免疫組化結(jié)果比較

與假手術(shù)組相比，各模型組CaSR和Caspase-12表達(dá)均明顯增加，說明各組建立SCIRI模型有效。與IR組相比，IPC組、NPS2390組CaSR和Caspase-12表達(dá)均明顯降低；與IPC-GdCl3組相比，IPC組CaSR和Caspase-12表達(dá)也明顯降低。說明IPC抑制了CaSR和Caspase-12的表達(dá)。見圖2、表1。

圖2 免疫組化觀察大鼠脊髓組織CaSR和Caspase-12表達(dá)(×400)

2.4 各組大鼠脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組可見極少凋亡染色陽性神經(jīng)細(xì)胞。IR組凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)相比IPC組明顯增加(P<0.05)，較NPS2390組也明顯增加(P<0.05)；IPC組較IPC-GdCl3組凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 TUNEL熒光染色觀察各組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況(×200)

表1 各組大鼠脊髓組織免疫組化與TUNEL染色定量結(jié)果

3 討論

SCIRI的發(fā)生和發(fā)展是包含多種機(jī)制的復(fù)雜病理過程，多年來一直沒有成熟的治療措施。缺血后適應(yīng)最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷過程中，通過在損傷早期及時給予幾個短暫的缺血再灌注循環(huán)，從而降低心肌耗氧量、改善心肌代謝，獲得了良好的治療作用[13]。近年來隨著對IPC研究的深入，IPC開始應(yīng)用于機(jī)體多個重要臟器中，相關(guān)研究表明在再灌注最早期即采取IPC治療可能獲得更好的效果[14]。受此啟發(fā)，本研究在再灌注3 min立即行IPC治療，并且以階梯形式逐漸減少再灌注時間，結(jié)果證實(shí)這種方法確實(shí)顯著提高了BBB評分，改善了大鼠后肢運(yùn)動功能損傷。

CaSR是一種特殊跨膜受體，是G蛋白耦聯(lián)受體超家族C家族成員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，在細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中起到關(guān)鍵作用[15-16]。有研究報道CaSR 激活增加了氧自由基產(chǎn)生，使組織缺血再灌注損傷加重[17]。為了探究IPC對CaSR的影響，本研究首先需要選擇CaSR的特異性激動劑和抑制劑。多數(shù)研究者認(rèn)為只需要在實(shí)驗(yàn)前2日連續(xù)大鼠尾靜脈注射氯化釓(GdCl3)試劑，即可有效激活CaSR，增加其表達(dá)量[18]，劑量以大鼠體重為指標(biāo)30 μmol/kg為宜[19]；在抑制劑方面，有報道稱小劑量精胺可以抑制CaSR，不過其抑制作用與代謝有關(guān)系，難以精準(zhǔn)把控，而NPS2390的組織富集作用較為穩(wěn)定[20-21]，以10 μmol/kg提前2日注射可減少CaSR表達(dá)，所以本研究將CaSR的抑制劑確定為NPS2390。TUNEL染色結(jié)果顯示，建模各組細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯多于假手術(shù)組，說明SCIRI是一種短時間內(nèi)難以逆轉(zhuǎn)的損傷；IPC組及NPS2390組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯低于IR組，說明IPC對大鼠SCIRI起到一定程度的保護(hù)作用，且與抑制劑保護(hù)作用相似。

本課題組前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)在大鼠SCIRI過程中，CaSR表達(dá)增加導(dǎo)致鈣超載從而加速細(xì)胞凋亡，并且CaSR激動劑會加重大鼠SCIRI，CaSR抑制劑則一定程度緩解大鼠SCIRI[7,11]。本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)印跡及免疫組化結(jié)果顯示，建模各組CaSR表達(dá)均高于假手術(shù)組，說明大鼠SCIRI模型建立成功；IPC組及NPS2390組較IR組CaSR表達(dá)均明顯減少，且IPC-GdCl3組CaSR表達(dá)量明顯高于IPC組，反映出IPC與CaSR抑制劑作用性質(zhì)相同，與CaSR激動劑則有拮抗作用，即IPC抑制了CaSR表達(dá)。

Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[22]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過Caspase-12獨(dú)立誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到損傷時，無活性的Caspase-12酶原被激活，具有活性的Caspase-12可以激活Caspase-9、Caspase-3等酶原，通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)促使細(xì)胞凋亡，因此Caspase-12在啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中具有核心作用[23]。本研究結(jié)果顯示，IPC組Caspase-12表達(dá)明顯低于IR組，可以看出IPC能夠抑制Caspase-12表達(dá)；其余各組比較結(jié)果幾乎與CaSR表達(dá)的組間比較一致。這是由于在大鼠脊髓缺血再灌注過程中，CaSR過表達(dá)引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，破壞了鈣的穩(wěn)態(tài)，從而誘發(fā)過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Caspase-12活化片段表達(dá)增多，經(jīng)一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡，因此IPC抑制了CaSR表達(dá)，繼而同步抑制了Caspase-12的表達(dá)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)IPC與CaSR抑制劑NPS2390具有類似的保護(hù)作用，但是臨床上CaSR抑制劑幾乎無應(yīng)用，可能是由于CaSR存在于機(jī)體較多組織器官，盲目用藥會引起難以預(yù)知的毒副作用。但I(xiàn)PC治療效果是否優(yōu)于抑制劑或者兩者之間是否有預(yù)防及治療上的協(xié)同作用，有待深入研究。

近年來關(guān)于大鼠腦組織缺血再灌注損傷的研究證實(shí)，遠(yuǎn)隔缺血后處理能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞的CaSR表達(dá)[24]，但是IPC調(diào)控CaSR表達(dá)的機(jī)制尚不明朗。我們推測其可能機(jī)制為：在脊髓發(fā)生缺血再灌注后第一時間進(jìn)行IPC操作，使細(xì)胞很快適應(yīng)灌注狀態(tài)，部分已經(jīng)激活的CaSR重新失去活性，這就解釋了IPC使CaSR蛋白表達(dá)下調(diào)的原因。關(guān)于CaSR與Caspase-12的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，目前認(rèn)為CaSR的表達(dá)下調(diào)使Ca2+內(nèi)流也相應(yīng)減少，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)相對平衡，誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激較少或者應(yīng)激持續(xù)時間較短，繼而Caspase-12活化減少，所以Caspase-12蛋白相應(yīng)下調(diào)。

綜上所述，IPC對大鼠SCIRI具有保護(hù)作用，且抑制脊髓組織中CaSR及Caspase-12的表達(dá)，其保護(hù)機(jī)制或可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少有關(guān)。但I(xiàn)PC減輕脊髓缺氧復(fù)氧損傷的機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑錯綜復(fù)雜，仍需進(jìn)一步探究。