李錦意 張婷 柳莉丹 陳永鋒

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科，廣州510000

Sprouty 蛋白是1998 年Hacohen 等發(fā)現(xiàn)的Ras/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信號通路特異性抑制蛋白［1］。各階段胚胎和成人組織廣泛表達Sprouty1、2 和4。Sprouty 蛋白可以拮抗受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信號通路，發(fā)揮不同的功能，包括抑制人類胚胎干細胞增殖、轉(zhuǎn)移及分化。國內(nèi)外研究顯示，Sprouty 參與多種腫瘤的增殖、分化及轉(zhuǎn)移，其中Sprouty1 在多種類型的腫瘤中表達下調(diào)，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌，尤其是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤［2?3］。而Song 等［4］用多變量分析表明Sprouty2 的表達下調(diào)與肝癌高度惡性表型如血管侵襲和晚期腫瘤分期相關(guān)。尋常型銀屑病是一種慢性炎癥性紅斑鱗屑性皮膚病，易復(fù)發(fā)，與角質(zhì)形成細胞增殖分化密切相關(guān)。而參與銀屑病發(fā)病機制的MAPK激酶控制著各種重要功能，如細胞增殖、分化、基因表達和角質(zhì)形成細胞凋亡［5?6］。我們檢測尋常型銀屑病患者中Sprouty蛋白質(zhì)和mRNA 的表達水平，探討Sprouty 在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達與銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評分的相關(guān)性和臨床意義。

對象與方法

一、對象

2018 年5-11 月選擇南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科門診就診的尋常型銀屑病患者15 例，以我院整形外科行整形手術(shù)者10 例為健康對照。所有患者取材前1 個月內(nèi)未接受過系統(tǒng)治療，2 周內(nèi)未外用銀屑病治療藥物，排除患有紅斑狼瘡、天皰瘡、皮肌炎等自身免疫性皮膚病、嚴重感染和合并肝腎及其他嚴重疾病的患者以及懷孕、哺乳期婦女。健康對照組均排除銀屑病和其他自身免疫性皮膚病，并經(jīng)組織病理學(xué)證實取材皮膚正常。本研究已經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號GDDHLS?20180309），所有受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為上?；蚩萍加邢薰井a(chǎn)品；兔抗人Sprouty1、2、4 多克隆抗體、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）均為英國Abcam 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒為北京康為世紀公司產(chǎn)品；超敏型電化發(fā)光（ECL）底物為廣東鉑西生物科技有限公司產(chǎn)品。

三、實驗方法

1.標(biāo)本處理：選取尋常型銀屑病患者軀干或四肢皮損及健康對照正常皮膚組織，各切取約1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm 組織，平均分成3 份，其中2 份分別放入標(biāo)記好的凍存管中，-80 ℃液氮凍存，用于Western 印跡和RT?PCR 檢測；1 份用4%甲醇固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

2. 免疫組化檢測Sprouty 蛋白表達：石蠟標(biāo)本切片脫蠟水化；加入烘箱脫膜液及95%乙醇高溫脫蠟，流動水中冷卻；滴入3%H2O2溶液室溫避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次；分別滴加抗Sprouty1（1∶100）、2（1∶400）和4（1∶500）抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次。滴加羊抗兔多克隆抗體，37 ℃水浴20 min，PBS 沖洗3 次。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，95%乙醇置換去水。中性樹膠封片，鏡檢，拍照。光鏡下觀察，細胞內(nèi)見棕黃色顆粒即Sprouty 陽性，細胞著色強度高于背景為非特異性染色。

3.RT?PCR檢測尋常型銀屑病皮損和對照組皮膚中Sprouty mRNA 表達：將凍存組織研磨后用Trizol?A 一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度。本實驗選用兩管反應(yīng)體系對目的基因和內(nèi)參照進行擴增，建立總體積為20 μl 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄完成后，取2 μl cDNA 進行PCR 擴增。擴增條件：94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共進行50個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后60 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物序列：GADPH 正向5′-AAGTATGACAACAGCCT CAAG-3′，反向3′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-5′；Sprouty1 正 向5′-ATGGATCCCCAAAATCAAC A-3′，反向3′-CGAGGAGCAGGTCTTTTCAC-5′；Sprouty2 正向5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′，反向3′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-5′；Sprouty4正 向5′-CCCGGCTTCAGGATTTAC-3′，反 向3′-GCTGGACCATGACTGAGTTG-5′。RT?PCR反應(yīng)結(jié)束后，LightCycler II DNA擴增儀自動分析并計算Ct值，以2-ΔΔCt為該目的基因mRNA 的相對表達量，2-ΔΔCt>1表示目的基因表達上調(diào)，反之下調(diào)。

4.Western印跡法檢測銀屑病皮損和正常對照皮膚Sprouty的表達：切除多余脂肪組織，保留表皮和真皮組織，提取皮損和正常皮膚組織蛋白，用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將聚偏氟乙烯膜浸入5%牛血清白蛋白封閉液，于室溫置搖床平緩搖動1 h；加入抗Sprouty1（1∶1 000）、Sprouty2（1∶1 000）和Sprouty 4（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜，再加入羊抗兔多克隆抗體室溫置搖床平緩搖動1 h，回收一抗和二抗后均用Tris?Buffered Saline and Tween 20（TBST）漂洗3 次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光，曝光，顯影，定影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Gel?analyzer 分析系統(tǒng)對目的顯色條帶進行吸光度（A值）分析和掃描，觀察各實驗組目的蛋白條帶灰度，以內(nèi)參GADPH 蛋白條帶灰度作為參照，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達水平。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量資料以±s 表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。Sprouty 蛋白表達強度與PASI 評分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)ɑ=0.05。

結(jié) 果

一、免疫組化檢測結(jié)果

見圖1。Sprouty1在對照組表皮全層細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中表達，呈深棕色，在顆粒層強表達，在銀屑病皮損顆粒層細胞的細胞膜有少量表達，呈淺棕色。Sprouty4 在銀屑病皮損棘細胞層的細胞核膜和核仁中表達，而在對照組棘細胞層整個細胞核中表達，均呈深棕色。Sprouty2 在兩組棘細胞層的細胞膜上少量表達，呈淡黃色。

二、RT?PCR檢測結(jié)果

見表1。銀屑病皮損Sprouty1 mRNA表達強度低于對照組（P＜0.05），而Sprouty4 mRNA表達強度高于對照組（P＜0.05），Sprouty2 mRNA 表達在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

三、Western印跡法檢測結(jié)果

Western 印跡法檢測顯示，銀屑病皮損和正常對照皮膚中均有Sprouty1、2 和4 的表達，但銀屑病皮損Sprouty1 蛋白表達量低于對照組（P＜0.001），而Sprouty4 蛋白表達量高于對照組（P＜0.001），Sprouty2 蛋白表達兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.201）。見表1、圖2。

圖1 免疫組化檢測Sprouty1、Sprouty4 和Sprouty2 的表達（×100） 1A、1B：Sprouty1在正常皮膚全層表達，在銀屑病皮損顆粒層弱表達；1C、1D：Sprouty4 在正常皮膚及銀屑病皮損中全層表達；1E、1F：Sprouty2 在正常皮膚及銀屑病皮損中少量表達于棘層中下部

四、銀屑病皮損Sprouty 蛋白表達量與PASI 評分的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析顯示，15 例尋常型銀屑病患者PASI 評分與Sprouty1 蛋白相對表達量呈負相關(guān)（r =-0.628，P = 0.012），與Sprouty4 蛋白呈正相關(guān)（r=0.812，P ＜0.001），與Sprouty2蛋白無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（r=0.436，P=0.104）。見圖3。

討 論

RTK 信號由RAS?RAF?MEK?MAPK 級聯(lián)反應(yīng)和PI3K?AKT 通路調(diào)節(jié)，這兩個通路由負反饋環(huán)路調(diào)節(jié)。MAPK信號通路是細胞內(nèi)增殖、分化中至關(guān)重要的信號通路。Tseng等［7］研究表明，MAPK被激活后通過與血管內(nèi)皮生長因子相互作用促進血管形成，在表皮中促進細胞生長、增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，從而參與銀屑病的發(fā)病過程。也有研究顯示，CKLF1?C19 多肽通過抑制MAPK 途徑抑制炎癥細胞浸潤和微血管細胞增殖，從而阻止銀屑病的進展［8］。Sprouty 蛋白的表達異常可能表明RTK/Ras/Raf/MAPK 信號的異?；罨?］。Sprouty蛋白和關(guān)鍵的負調(diào)控因子限制RTK 活化的強度和持續(xù)時間，阻礙RAS?RAF?MEK?MAPK 和PI3K?AKT 信號通路活化［10］。

本研究免疫組化顯示，Sprouty1 在正常皮膚顆粒層胞膜和胞質(zhì)高表達，而在尋常型銀屑病皮損的顆 粒 層 胞 膜 弱 表 達，與Wang 等［11］研 究 發(fā) 現(xiàn)Sprouty1 主要位于正常皮膚的顆粒層角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)中的結(jié)果一致。我們通過RT?PCR 和Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，Sprouty1在尋常型銀屑病皮損表達減少，而Wang 等發(fā)現(xiàn)Sprouty1 可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白來抑制增殖并促進細胞凋亡，且Sprouty1 可能在表皮終末分化中起作用，提示Sprouty1 可能參與角質(zhì)形成細胞的分化。Sprouty1可能是正常皮膚表皮角質(zhì)形成細胞和皮膚炎癥反應(yīng)中的負反饋調(diào)節(jié)劑，增強Sprouty1表達可能具有增強抗炎作用的可能性，從而可能抑制銀屑病發(fā)病。但Sprouty1 參與銀屑病的明確機制仍需進一步研究。

Sprouty4 在本文對照組皮膚和尋常型銀屑病組皮損表皮細胞胞核均高表達，RT?PCR和Western印跡檢測顯示，尋常型銀屑病組Sprouty4 mRNA 和蛋白表達增多。Shi 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Sprouty4 介導(dǎo)MAPK通路的蛋白質(zhì)復(fù)合物磷酸化和去磷酸化，參與多種生物學(xué)功能，包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞間連接、轉(zhuǎn)錄控制、細胞遷移和信號通路調(diào)節(jié)。Xu 等［13］發(fā)現(xiàn)，Sprouty4 通過結(jié)合相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)FGFR?RAS 途徑來抑制ERK 磷酸化。Sprouty4 或許通過參與MAPK 通路相關(guān)蛋白磷酸化或去磷酸化參與細胞的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等，從而參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。但具體機制以及更多可能相關(guān)的信號通路仍需進一步研究。而Sprouty4 與Spouty1 在角質(zhì)形成細胞分布不同，可能二者作用于不同階段角質(zhì)形成細胞，從而相輔相成促進銀屑病的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)性分析顯示，Sprouty1 與PASI 評分呈負相關(guān)，而Sprouty4 則呈正相關(guān)，進一步支持Sprouty1、Sprouty4與銀屑病密切相關(guān)的觀點。

表1 尋常型銀屑病組皮損和對照組正常皮膚Sprouty mRNA和蛋白的表達水平（±s）

表1 尋常型銀屑病組皮損和對照組正常皮膚Sprouty mRNA和蛋白的表達水平（±s）

注：a 以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達水平

組別例數(shù)mRNA表達（2-ΔΔCt）蛋白表達a Sprouty1 0.972±0.105 0.844±0.169 2.143 0.043 Sprouty2 1.005±0.012 0.097±0.091-0.648 0.523 Sprouty4 0.714±0.615 1.727±1.017 2.814 0.010 Sprouty1 0.413±0.108 0.148±0.141-5.015<0.001對照組銀屑病組t值P值10 15 Sprouty2 0.148±0.141 0.292±0.154-1.316 0.201 Sprouty4 0.584±0.304 1.306±0.283 6.063<0.001

圖2 Western印跡檢測Sprouty1、Sprouty4和Sprouty2的表達 與對照組相比，Sprouty1在尋常型銀屑病皮損中表達減少，Sprouty4表達增多，Sprouty2表達無明顯差異。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖3 15例尋常型銀屑病患者Sprouty1（4A）、Sprouty4（4B）、Sprouty 2（4C）蛋白表達與銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評分相關(guān)性

免疫組化、RT-PCR 和Western 印跡檢測顯示，Sprouty2 mRNA和蛋白在健康對照組和尋常型銀屑病組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Sprouty2可能與銀屑病發(fā)病發(fā)展無相關(guān)性。由于大量研究提示，Sprouty2 與腫瘤相關(guān)，Sprouty2 與銀屑病的關(guān)系仍需進一步研究。

綜上所述，在尋常型銀屑病患者皮損中Sprouty1表達下調(diào)，而Sprouty4表達上調(diào)，且二者均與PASI 評分存在相關(guān)性，提示Sprouty1 和Sprouty4在尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程可能發(fā)揮重要作用，為進一步闡明銀屑病發(fā)病機制及臨床治療提供新思路。但Sprouty1和Sprouty4如何通過相關(guān)蛋白或通路參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展，仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突