王祖文，沈以紅，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400716；2.西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

肝纖維化是世界范圍內(nèi)的常見疾病，主要由各種慢性肝損傷引起，包括病毒、酒精、藥物誘導(dǎo)、膽汁淤積和代謝性疾病[1]，其主要特征是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積[2]。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，氧化應(yīng)激發(fā)揮了重要作用，且與其他因素（如炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬）相互影響、共同參與[3]。在肝纖維化病理生理過程中，采取一定手段來降低氧化應(yīng)激及炎癥水平對(duì)機(jī)體的影響對(duì)阻礙肝纖維化發(fā)展進(jìn)程具有重要意義。目前，除了采用藥物防治肝纖維化，許多研究者也把目光轉(zhuǎn)向一些天然活性物質(zhì)，如多糖、黃酮、生物堿類化合物。據(jù)報(bào)道百花花青素[4]、老鼠簕生物堿[5]、金蟬花多糖[6]等活性物質(zhì)可通過抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激、降低炎癥反應(yīng)，來抑制HSC的激活和ECM沉積，從而逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化。

桑葉生物堿是桑葉的特征活性成分，是糖環(huán)上的氧原子被氮原子取代的一系列多羥基生物堿，具有降糖降脂[7-8]、抑制病毒活性[9]、減輕腎損傷[10]、改善小鼠氧化損傷[11]等作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿可顯著降低肝纖維化小鼠血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，減輕小鼠肝纖維病變程度[12]。鑒于目前鮮見桑葉生物堿在減輕氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)來改善肝纖維化方面的相關(guān)報(bào)道，因此本研究從這兩點(diǎn)入手，探討桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠機(jī)體抗氧化能力和炎癥因子的影響，旨在為進(jìn)一步研究桑葉功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60 只（4 周齡），體質(zhì)量（20±2）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003；基礎(chǔ)飼料購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；高脂飼料為重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，含基礎(chǔ)飼料69.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、豬油12%、蔗糖10%、蛋黃粉4%、膽固醇4%、膽酸鈉0.5%。

桑葉粉末由重慶畜牧科學(xué)院蠶研所提供；桑葉生物堿（總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.57%）為重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[13]。

橄欖油、四氯化碳（CCl4） 成都市科龍化工試劑廠；水飛薊賓（純度98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；Masson三色染色試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EG1105H型石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica公司；包埋盒江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀美國(guó)基因有限公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；生物顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社；ALPAAI-4LSC型高速離心機(jī) 德國(guó)Christ公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；5880R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

本研究獲得西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)許可，小鼠按照西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），自由進(jìn)食飲水。60 只昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組（10 只）、造模組（50 只）。造模組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10% CCl4橄欖油溶液（5 mL/kgmb），隔天注射1 次，持續(xù)8 周，并在此期間給予高脂飼料喂養(yǎng)；正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等量橄欖油溶液，并給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模成功判定：正常對(duì)照組和造模組小鼠之間，血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、肝纖維4 項(xiàng)指標(biāo)（透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、III型前膠原、IV型膠原）水平差異顯著（P＜0.05），且肝纖維化小鼠肝臟組織病變明顯，膠原沉積。

將造模成功的50 只小鼠，隨機(jī)分成模型組、陽性藥物組和桑葉生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。桑葉生物堿低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kgmb的桑葉生物堿溶液，陽性藥物組灌胃100 mg/kgmb水飛薊賓水溶液，正常對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水（10 mL/kgmb），每日1 次，連續(xù)灌胃45 d，同時(shí)喂飼基礎(chǔ)飼料。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)樣品收集

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素鈉的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，取肝左葉置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定48 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為4 μm），進(jìn)行Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下（200×）進(jìn)行肝組織病理學(xué)觀察，拍照。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

稱取0.3 g肝組織，加入9 倍體積的生理鹽水，于冰浴條件勻漿后，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min取上清液待測(cè)。按照相應(yīng)的試劑盒說明書標(biāo)示的步驟測(cè)定肝組織TC、TG、HYP（堿水解法）以及血漿MDA、GSH、SOD、T-AOC水平；血漿IL-6、TNF-α及肝組織COX-2水平的測(cè)定按照酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒說明書標(biāo)示的步驟進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較數(shù)據(jù)顯著性差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠肝組織TC、TG、HYP含量的影響

CCl4產(chǎn)生的CCl3·自由基及一系列的活性氧與生物大分子共價(jià)結(jié)合將導(dǎo)致合成障礙，造成脂質(zhì)代謝紊亂，促使TC、TG在肝組織中大量積累[14-15]，在CCl4和高脂飲食兩種因素的聯(lián)合作用下會(huì)加快肝損傷向肝纖維化的形成[16]。ECM沉積是肝纖維化形成的主要特征之一，表現(xiàn)為膠原蛋白含量顯著增多。HYP是膠原蛋白所特有的氨基酸，其含量可反映細(xì)胞合成分泌膠原蛋白的水平，與肝纖維化程度呈正相關(guān)，是評(píng)估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的常用指標(biāo)[17]。

表 1 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠肝組織TC、TG、HYP含量的影響（n＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TC, TG and HYP in hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表1可知，正常對(duì)照組小鼠TC、TG、HYP處于較低水平。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織TC、TG、HYP含量顯著上升（P＜0.05），說明CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟不僅有大量脂質(zhì)積累、膠原蛋白增多，還出現(xiàn)了明顯的纖維化。與模型組比，陽性藥物組小鼠TC、TG、HYP含量分別顯著下降53.85%、44.44%、29.60%（P＜0.05）；桑葉生物堿各劑量組小鼠肝組織TC、TG、HYP含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，其中桑葉生物堿高劑量組TC、TG、HYP分別顯著降低53.85%、41.67%、28.81%（P＜0.05），與陽性藥物組間無顯著差異（P＞0.05），但未恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能有效降低肝纖維化小鼠TC、TG、HYP水平，減少ECM沉積，減輕肝纖維化程度。

2.2 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠血漿抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

在肝臟受到氧自由基的攻擊時(shí)，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)平衡被打破，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激。MDA是機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，過量時(shí)會(huì)嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，也是公認(rèn)的肝內(nèi)自由基產(chǎn)生的一個(gè)間接指標(biāo)[18]。內(nèi)源酶和非酶抗氧化劑共同構(gòu)成機(jī)體的一個(gè)復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，這些物質(zhì)共同作用以抵抗自由基對(duì)重要生物分子如蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)乃至機(jī)體組織的破壞[19]。GSH是一種重要的細(xì)胞無酶抗氧化劑，主要在肝臟中合成，廣泛分布于各種器官內(nèi)，是自由基的清除劑[20]。SOD是細(xì)胞中強(qiáng)大的酶抗氧化劑，與GSH共同作用清除肝內(nèi)的超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷；SOD水平可間接反映機(jī)體清除內(nèi)氧自由基的能力[21]。僅通過機(jī)體GSH、SOD水平來評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力是不全面的，因此采用T-AOC共同反映機(jī)體的總抗氧化能力[22]。

表 2 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠血漿中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on antioxidant defense indictors in plasma of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表2可知，正常對(duì)照組小鼠血漿中GSH濃度、SOD活力、T-AOC處于較高水平，MDA濃度處于較低水平。與正常對(duì)照組比，模型組小鼠MDA濃度顯著升高了130.67%（P＜0.05）；而GSH濃度、SOD活力、T-AOC分別顯著下降了81.10%、45.14%、57.89%（P＜0.05），說明小鼠肝臟受到自由基攻擊，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，清除自由基能力減弱。與模型組比，桑葉生物堿各劑量組的MDA濃度均有所降低，GSH濃度、SOD活力、T-AOC均有所上升；其中，桑葉生物堿高劑量組較模型組小鼠血漿的MDA濃度顯著下降了33.60%（P＜0.05），GSH濃度、SOD活力、T-AOC分別顯著升高了136.83%、45.14%、78.13%（P＜0.05）。高劑量桑葉生物堿對(duì)MDA、GSH的作用與該實(shí)驗(yàn)劑量的水飛薊賓效果相當(dāng)（P＞0.05），對(duì)SOD和T-AOC的作用效果不如水飛薊賓，二者差異顯著（P＜0.05）；但無論是該實(shí)驗(yàn)劑量下的桑葉生物堿還是水飛薊賓，均未使上述指標(biāo)恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能在一定程度上恢復(fù)肝纖維化小鼠的抗氧化能力，減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激水平。

2.3 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠炎癥因子的影響

氧化應(yīng)激和炎癥緊密聯(lián)系，一方面，氧化應(yīng)激能促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)；另一方面炎癥細(xì)胞活化后產(chǎn)生更多的活性氧，導(dǎo)致炎癥性病變后的氧化應(yīng)激水平升高[3]。有研究報(bào)道稱在肝纖維化動(dòng)物模型中，血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平隨著纖維化程度的加重而升高，呈正相關(guān)關(guān)系[24]。COX-2參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化、炎癥反應(yīng)等多種病理過程[24]。有研究認(rèn)為COX-2是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[25]，它介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在肝纖維化形成過程中起關(guān)鍵作用，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝臟受損，COX-2表達(dá)會(huì)明顯升高，進(jìn)而加劇肝損傷[26]。

由表3可知，正常對(duì)照組小鼠TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度和COX-2活力處于較低水平。與正常對(duì)照組比，模型組小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分別顯著升高了18.80%、19.92%、28.26%（P＜0.05），說明肝纖維化小鼠機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，肝損傷加劇。與模型組比，桑葉生物堿各劑量組小鼠上述指標(biāo)均有所下降；其中，桑葉生物堿高劑量組小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分別顯著下降了9.96%、11.06%、10.02%（P＜0.05），與該實(shí)驗(yàn)劑量的水飛薊賓效果相當(dāng)（P＞0.05），但均未恢復(fù)至正常水平。結(jié)果表明，桑葉生物堿在一定程度上降低肝纖維化小鼠機(jī)體炎癥水平。

表 3 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平的影響（n＝10）Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TNF-α,IL-6 and COX-2 in mice with hepatic fibrosis (n= 10)

2.4 桑葉生物堿對(duì)肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)的影響

圖 1 肝纖維化小鼠肝組織病理切片觀察結(jié)果（200×）Fig. 1 Histopathological observation of hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (200 ×)

肝組織經(jīng)Masson染色后，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。由圖1可知，正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列分布整齊，僅肝小葉內(nèi)中央靜脈管壁周圍有少量藍(lán)色膠原纖維（圖中黑色箭頭所指）。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)遭嚴(yán)重破壞，可見廣泛致密藍(lán)色膠原沉積，肝臟匯管區(qū)和中央靜脈周圍纖維組織增生明顯，且纖維組織向肝小葉內(nèi)延伸形成纖維間隔。與模型組比較，陽性藥物組和各劑量桑葉生物堿組的小鼠肝細(xì)胞索排列較為整齊，組織病變及纖維化均有不同程度的改善，以陽性藥物組和桑葉生物堿中、高劑量組改善效果更為明顯，但未恢復(fù)至正常水平。組織病理觀察結(jié)果與上述指標(biāo)測(cè)定結(jié)果一致，說明一定劑量的桑葉生物堿對(duì)肝纖維小鼠具有改善作用。

3 討 論

CCl4是使用最廣泛的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)肝纖維化的化學(xué)性肝臟毒物[27]，在與高脂飲食的聯(lián)合作用下，可加快實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化的形成[28]。其中，CCl4經(jīng)微粒體細(xì)胞色素氧化酶P450激活產(chǎn)生自由基CCl3·及Cl·，與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，引發(fā)氧自由基的生成[29-31]。本研究顯示，CCl4聯(lián)合高脂飲食作用導(dǎo)致肝纖維小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，機(jī)體抗氧化能力下降，炎癥水平升高。氧化應(yīng)激在肝損傷中扮演著重要角色，氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)和機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的失衡是肝纖維發(fā)病機(jī)制中常見情況[32]。有研究表明，桑葉生物堿能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激，減輕脂質(zhì)等生物大分子的氧化損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑葉生物堿能降低肝纖維化小鼠MDA含量，提高SOD、GSH、T-AOC的水平，猜測(cè)桑葉生物堿能通過降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化能力，來改善肝纖維化。在肝纖維化期間，炎癥和氧化應(yīng)激共同促進(jìn)肝纖維的形成。一些研究報(bào)道稱天然活性提取物可通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平來減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織炎癥壞死和肝纖維病變程度。如馬冬梅等[33]報(bào)道田基黃提取物可通過調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α及IL-1β水平來減輕肝纖維化小鼠癥狀；Chiu等[34]的研究也得到類似結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在灌胃桑葉生物堿后，肝纖維化小鼠機(jī)體IL-6、TNF-α、COX-2炎癥因子水平降低，膠原蛋白含量減少，病理切片同樣觀察到肝組織膠原纖維含量減少，推測(cè)桑葉生物堿可通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平從而改善肝纖維化。

綜上所述，桑葉生物堿可改善小鼠肝纖維化程度，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎有關(guān)。HSC的激活與ECM沉積是肝纖維化典型特征，氧化應(yīng)激和炎癥能直接激活HSC，而活化的HSC可反過來激活氧化應(yīng)激和炎癥，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[3,33]，因此降低小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥水平對(duì)改善肝纖維化有重要意義。本實(shí)驗(yàn)僅是對(duì)該方面做了初步探討，具體機(jī)制尚不明確，桑葉生物堿能否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激介導(dǎo)肝纖維化中涉及的相關(guān)細(xì)胞因子如核轉(zhuǎn)錄因子κB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smads及下游通路來調(diào)控HSC表達(dá)、改善肝纖維癥狀，還需要進(jìn)一步深入研究。