楊忠敏，沈以紅，黃先智，王祖文，丁曉雯,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400716；2.西南大學(xué)科技處，重慶 400716）

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）是機(jī)體的正常代謝產(chǎn)物，適量的ROS、RNS對(duì)維持生物體細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要[1]。但當(dāng)機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)的平衡遭到破壞時(shí)，機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的高活性氧、氮分子（如ROS、RNS），導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[2]。蛋白質(zhì)是機(jī)體一類(lèi)重要的生物大分子，極易被高活性分子攻擊，使其氨基酸殘基發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變[3]。已有研究表明，許多疾病如阿爾茨海默病[4]、尿毒癥[5]、帕金森病[6]等的發(fā)生與蛋白質(zhì)的氧化水平密切相關(guān)。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear erythroid related factor2，Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch like ECH-associated protein-1，Keap1）信號(hào)通路被認(rèn)為是最重要的內(nèi)源性抗氧化通路。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)抗異源性物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游II相解毒酶和抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而增強(qiáng)抗氧化作用，而Keap1是Nrf2的調(diào)控因子[7]。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞中Keap1與Nrf2結(jié)合在一起并抑制Nrf2的激活，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2和Keap1分離，Nrf2被激活并與抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合，進(jìn)而激活靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[8]。

藥食兩用植物中存在的天然抗氧化劑對(duì)于預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。桑葉生物堿作為一類(lèi)以1-脫氧野尻霉素為主的多羥基哌啶生物堿，已被證實(shí)具有降脂、降糖等作用[9-10]。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿在體外模擬胃腸消化體系中具有較強(qiáng)的抗氧化潛力[11]，同時(shí)也證實(shí)了該化合物在小鼠體內(nèi)能增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力，對(duì)小鼠體內(nèi)大分子物質(zhì)的氧化損傷具有改善作用[12]。但目前針對(duì)桑葉生物堿改善蛋白氧化損傷特別是作用機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導(dǎo)建立小鼠氧化損傷模型，然后給實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃不同劑量的桑葉生物堿，在前期研究的基礎(chǔ)上從Nrf2/Keap1信號(hào)通路出發(fā)深入探討桑葉生物堿在體內(nèi)對(duì)蛋白氧化損傷的改善作用及機(jī)理，為桑葉生物堿的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，為防御機(jī)體蛋白氧化損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

基礎(chǔ)飼料、SPF級(jí)昆明種小鼠（60 只，4 周齡，平均體質(zhì)量為20 g左右）均由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003。

桑葉粉末 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院；桑葉生物堿為西南大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[11]，采用硅鎢酸沉淀法[13]測(cè)定總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.57%。

D-Gal（純度≥99%）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（純度≥98%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；蛋白羰基（protein carbonyl，PCO）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1）酶聯(lián)吸附免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒南京建成生物工程研究所；高純總RNA快速提取試劑盒北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTMII（Til RNaseH Plus）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Symergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)基因有限公司；811DK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf AG公司；KQ5200DB超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；T100T型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，qPCR）儀、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)、GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Thermo公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]開(kāi)展動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的飼養(yǎng)方法，確定桑葉生物堿低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/kgmb，實(shí)驗(yàn)為期8 周。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型建立

60 只雄性SPF級(jí)昆明種小鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分出10 只為正常對(duì)照組，連續(xù)腹腔注射與造模組等量的生理鹽水；其余50 只小鼠連續(xù)腹腔注射D-Gal（1 000 mg/kgmb）20 d，構(gòu)造氧化應(yīng)激模型。以造模組、正常對(duì)照組小鼠血清中MDA、SOD水平是否存在顯著差異作為判定指標(biāo)。

正常對(duì)照組小鼠繼續(xù)灌胃生理鹽水；將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組（灌胃生理鹽水）、陽(yáng)性藥物組（灌胃200 mg/kgmbGSH）以及桑葉生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠每天稱(chēng)體質(zhì)量1 次，并根據(jù)體質(zhì)量變化按照0.1 mL/10 gmb每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃8 周。

小鼠按照西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間室內(nèi)通風(fēng)條件良好，控制動(dòng)物房溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00 a.m.～21∶00 p.m.），所有小鼠均喂飼基礎(chǔ)飼料，自由覓食、飲水。

1.3.3 樣本采集

8 周灌胃結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠禁食不禁水12 h，摘取小鼠眼球取血于肝素鈉采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，上清液即為血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后，將?shí)驗(yàn)小鼠頸椎脫臼處死，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血漿PCO、AOPP、3-NT的水平及SOD、GSH-Px、NQO1的活力測(cè)定

均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行操作。

1.3.5 肝組織SOD、GSH-Px、NQO1、Nrf2、Keap1mRNA表達(dá)的測(cè)定

按照RNA提取試劑盒的方法提取肝臟組織總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL作為反應(yīng)模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如表1所示。qPCR條件：95 ℃、4 min預(yù)變性；95 ℃、15 s變性，60℃、30 s退火，共39 個(gè)循環(huán)。以β-actin作內(nèi)參基因，分別測(cè)定肝組織SOD、GSH-Px、NQO1、Nrf2、Keap1的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對(duì)小鼠蛋白氧化損傷的影響

PCO是蛋白質(zhì)分子被ROS攻擊后產(chǎn)生的，A OPP是氯氧化劑次氯酸作用于蛋白質(zhì)而形成的含雙酪氨酸的交聯(lián)產(chǎn)物，兩者均可作為蛋白氧化損傷的敏感指標(biāo)[5,15]。而RNS攻擊蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基，使蛋白質(zhì)發(fā)生硝化反應(yīng)產(chǎn)生3-NT，也是氧化應(yīng)激指標(biāo)之一[16]。

表 2 桑葉生物堿對(duì)D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿PCO、AOPP、3-NT水平的影響（n＝10）Table 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on PCO, AOPP and 3-NT levels in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表2可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠PCO、AOPP、3-NT水平分別增加了57.93%、180.52%、161.27%（P＜0.01），表明模型組小鼠發(fā)生了明顯的蛋白氧化損傷。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組PCO、AOPP、3-NT水平分別減少了36.52%、63.36%、60.22%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組PCO、AOPP、3-NT水平分別減少了36.43%、61.81%、58.13%（P＜0.01），且恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05），表明桑葉生物堿對(duì)氧化應(yīng)激小鼠蛋白氧化損傷有較好的改善作用。

2.2 桑葉生物堿對(duì)小鼠抗氧化酶活力的影響

機(jī)體存在著內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化酶SOD、GSH-Px是其重要的組成部分，它們可通過(guò)分解ROS/RNS而對(duì)機(jī)體組織起到保護(hù)作用[17]。

表 3 桑葉生物堿對(duì)D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿SOD、GSH-Px活力的影響（n＝10）Table 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on SOD and GSH-Px activity in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表3 可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠SOD、GSH-Px活力分別下降了34.13%、63.88%（P＜0.01），表明模型組小鼠的抗氧化酶系統(tǒng)活力大大降低，對(duì)氧化應(yīng)激的改善能力下降。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組SOD、GSH-Px活力分別升高50.05%、173.07%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組SOD、GSH-Px活力分別升高了48.89%、167.17%（P＜0.01），且恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05）。表明桑葉生物堿能使氧化應(yīng)激小鼠抗氧化酶活力逐漸恢復(fù)，進(jìn)而達(dá)到清除機(jī)體過(guò)量自由基的作用。

2.3 桑葉生物堿對(duì)小鼠II相解毒酶活力的影響

II相代謝酶是細(xì)胞在遭受異源性物質(zhì)侵襲發(fā)生氧化應(yīng)激損傷或細(xì)胞毒性、致癌性等可能性增加時(shí)發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞作用的蛋白酶，又稱(chēng)II相解毒酶或II相抗氧化酶。NQO1是重要的II相解毒酶之一。

表 4 桑葉生物堿對(duì)D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿NQO1活力的影響（n＝10）Table 4 Effects of mulberry leaf alkaloids on NQO1 activity in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表4可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠NQO1活力下降了46.97%（P＜0.01），表明模型組小鼠保護(hù)細(xì)胞不被氧化損傷的能力大大減弱。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組NQO1活力升高了87.92%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組NQO1活力升高了85.12%（P＜0.01），也恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05）。表明桑葉生物堿能改善氧化應(yīng)激小鼠NQO1活力。

2.4 桑葉生物堿對(duì)小鼠抗氧化損傷酶mRNA表達(dá)的影響

SOD、GSH-Px、NQO1是機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的重要組成酶，且主要表達(dá)靶器官是肝臟組織[18]。如果機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，則SOD、GSH-Px、NQO1的mRNA表達(dá)量將會(huì)減少。本研究考察了桑葉生物堿是否從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)上述3 種酶的活力水平。

2.4.1 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達(dá)的影響

圖 1 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟SOD1（A）、SOD2（B）和GSH-Px（C）mRNA表達(dá)的影響Fig. 1 Effects of mulberry leaf alkaloids on SOD1 (A), SOD2 (B) and GSH-Px (C) mRNA expression in mouse liver

由圖1 可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達(dá)分別下降了50.71%、51.22%、59.06%（P＜0.01）。與模型組相比，桑葉生物堿高劑量組SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達(dá)分別上升了96.96%、94.26%、116.71%（P＜0.01），且恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05），說(shuō)明桑葉生物堿通過(guò)調(diào)控SOD1、SOD2和GSH-Px的mRNA表達(dá)水平使得SOD、GSH-Px活性水平升高進(jìn)而清除機(jī)體自由基，防止蛋白遭受自由基攻擊導(dǎo)致氧化損傷。

2.4.2 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟NQO1mRNA表達(dá)的影響

圖 2 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟NQO1 mRNA表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on NQO1 mRNA expression in mouse liver

由圖2可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠NQO1mRNA表達(dá)水平下降了52.46%（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組NQO1mRNA表達(dá)水平增加了102.16%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組NQO1mRNA表達(dá)水平增加了101.51%（P＜0.01），且恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05）。說(shuō)明桑葉生物堿通過(guò)調(diào)控NQO1的mRNA表達(dá)水平使得NQO1活性逐漸恢復(fù)。

2.5 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟Nrf2、Keap1 mRNA表達(dá)的影響

Nrf2是亮氨酸轉(zhuǎn)錄因子家族成員中最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟、腎等參與代謝和解毒的組織中表達(dá)，Keap1是Nrf2的特異性受體[19]。為考察桑葉生物堿在機(jī)體中改善蛋白氧化損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究測(cè)定Nrf2、Keap1在肝臟中的mRNA表達(dá)水平。

圖 3 桑葉生物堿對(duì)小鼠肝臟Nrf2（A）和Keap1（B）mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on Nrf2 (A) and Keap1 (B)mRNA expression in mouse liver

由圖3可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠Nrf2mRNA表達(dá)水平下降了40.46%（P＜0.01），Keap1mRNA表達(dá)水平增加了56.85%（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組Nrf2mRNA表達(dá)水平增加了66.55%（P＜0.01），Keap1mRNA表達(dá)水平降低了34.72%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組Nrf2mRNA表達(dá)水平增加了63.01%（P＜0.01），Keap1mRNA表達(dá)水平降低了33.54%（P＜0.01），且恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異水平（P＞0.05）。研究結(jié)果說(shuō)明桑葉生物堿能通過(guò)調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)通路進(jìn)而增加下游靶基因SOD、GSH-Px及NQO1mRNA表達(dá)，改善機(jī)體抗蛋白氧化損傷的能力。

3 討 論

蛋白質(zhì)分子在機(jī)體中占有特殊地位，是機(jī)體細(xì)胞的基本構(gòu)成物質(zhì)，同時(shí)，它也是生物體中很多重要的代謝物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的載體[20]。Stadtman等[21]研究表明，機(jī)體中的高活性分子攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，最終生成相應(yīng)的羰基衍生物，其中金屬離子催化氧化系統(tǒng)是產(chǎn)生PCO的主要途徑。AOPP是自由基攻擊血清蛋白的氧化作用產(chǎn)生的雙酪氨酸蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，也是蛋白氧化損傷的特異性標(biāo)志之一[22]。酪氨酸硝基化會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)和代謝酶的調(diào)節(jié)，其產(chǎn)物3-NT不僅能作為一些疾病的生物標(biāo)志物，也能促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展[23]。大量研究已表明，一些天然產(chǎn)物能夠抑制自由基對(duì)蛋白質(zhì)的氧化損傷[24]，如張?jiān)碌萚25]研究表明，辣椒堿能抑制蛋白質(zhì)硝基化及PCO水平。本研究結(jié)果表明，經(jīng)桑葉生物堿調(diào)控后，已發(fā)生了氧化應(yīng)激的小鼠其PCO、AOPP及3-NT水平可逐漸恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異的水平（P＞0.05），表明桑葉生物堿與其他生物堿化合物作用一樣，對(duì)機(jī)體的蛋白氧化損傷具有較好的改善作用，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

機(jī)體內(nèi)存在一套內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)，其對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激應(yīng)答是動(dòng)態(tài)的，在一定程度下可與氧化應(yīng)激形成平衡。SOD、GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中重要的內(nèi)源性抗氧化酶：SOD可通過(guò)歧化反應(yīng)將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，之后GSH-Px可將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，從而保護(hù)生物大分子免受氧化應(yīng)激損傷[26-27]。NQO1是真核細(xì)胞中普遍存在的一類(lèi)黃素類(lèi)蛋白酶，它能催化醌類(lèi)及其衍生物還原并使其毒性降解，從而阻止它們進(jìn)一步參與機(jī)體的氧化還原反應(yīng)和產(chǎn)生ROS，進(jìn)而減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，200 mg/kgmb桑葉生物堿調(diào)控后，小鼠血漿中SOD、GSH-Px、NQO1活力及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，且恢復(fù)到與正常對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組無(wú)顯著性差異的水平（P＞0.05），提示桑葉生物堿能從轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)機(jī)體抗氧化酶的活力，這與彭曉蝶[29]、郝麒麟[30]等研究結(jié)果相一致。

為進(jìn)一步探討桑葉生物堿對(duì)蛋白氧化損傷的改善作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其作用的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。Keap1/Nrf2是在機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要作用的信號(hào)通路。Nrf2能與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合激活特定的下游靶基因轉(zhuǎn)錄，且Nrf2水平與SOD、GSH-Px、NQO1的表達(dá)呈正相關(guān)[31]。Keap1是69 kDa的細(xì)胞質(zhì)蛋白伴侶分子，是Keap1/Nrf2通路的主要調(diào)節(jié)器，它可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)打開(kāi)或者關(guān)閉Keap1-Nrf2-ARE通路[32]。大量研究表明，許多生物堿化合物（如野百合堿、毛果蕓香堿等）對(duì)Nrf2/Keap1具有調(diào)控作用[33]。本研究結(jié)果表明桑葉生物堿可以顯著下調(diào)Keap1mRNA表達(dá)，上調(diào)Nrf2mRNA表達(dá)，表明桑葉生物堿對(duì)Nrf2/Keap1通路有較好的調(diào)控作用。

綜上所述，桑葉生物堿可能通過(guò)激活Keap1/Nrf2信號(hào)通路，增加下游SOD、GSH-Px及NQO1mRNA的表達(dá)，從而提高SOD、GSH-Px及NQO1活力，促進(jìn)機(jī)體ROS/RNS清除，達(dá)到改善生物體內(nèi)蛋白質(zhì)分子氧化損傷的目的。